Principi in metode viroloških raziskav. Določitev indikacij za bakteriološke, virološke, serološke študije pri dešifriranju etiologije raka in vrednotenju rezultatov

Virološke študije so študije, namenjene izolaciji virusov in preučevanju njihovih lastnosti ter ugotavljanju etiološke povezave virusov z določenimi boleznimi.

Material za raziskave se vzame glede na mesto prevladujočih virusov v bolnikovem telesu in na poti njihovega sproščanja med zunanje okolje. Material zberemo v sterilne posode, čim prej dostavimo v laboratorij in do preiskave shranimo zamrznjenega ali na ledu. Pred uporabo se material za izolacijo virusa obdela (in) za zatiranje tuje mikroflore in obdela za odstranitev velikih delcev.

Virusi se izolirajo z okužbo laboratorijskih živali, piščančjih zarodkov in tkivnih kultur z materialom, ki vsebuje virus. Izbira metode izolacije je odvisna od domnevnega povzročitelja bolezni. Tako se tkivne kulture (glej) uporabljajo pri delu z virusi, ki niso patogeni za laboratorijske živali, ali ko jih odkrijejo v tkivni kulturi prej kot pri okužbi živali. Piščančji zarodki so okuženi, da se izolirajo povzročitelji bolezni, infektivni mumps (v amnijski in alantoični votlini), (v rumenjakovi vrečki), črne koze (v horioalantoični membrani).

Med laboratorijskimi živalmi za izolacijo virusov najpogosteje uporabljajo bele miši, sledijo jim zajci, podgane, morski prašički in opice. Pri arbovirusih je najučinkovitejši vnos materiala, ki vsebuje viruse, v glavo ali pri pnevmotropnih virusih na sluznico dihalnih poti, pri virusih črnih koz pa na skarificirano roženico.

Izolacija virusa je najučinkovitejša pri akutno obdobje bolezni. Bistvena točka pri vzpostavitvi virusne narave bolezni so rezultati seroloških študij serumov, večkrat odvzetih istemu bolniku na začetku bolezni in v obdobju okrevanja. Odkrivanje protiteles proti izoliranim virusom v drugem serumu v titru, ki je 4 ali večkrat večji kot v prvem serumu, kaže na etiološko povezavo virusov s to boleznijo.

Zgodaj in hitra metoda detekcija virusnih antigenov je metoda fluorescentnih protiteles, ki temelji na specifični fiksaciji protiteles, označenih s fluorokromom, na površini antigena. Antigen je zlahka zaznan s fluorescenčno mikroskopijo (glej) zaradi svetle fluorescence protiteles, adsorbiranih na antigenu. Metoda fluorescentnih protiteles se uporablja za pregled brisov bolnikov, histoloških rezov prizadetih tkiv in pripravkov tkivnih kultur. Uporabljajo se tudi za odkrivanje elementarnih teles (virionov) (glej). Med drugimi morfološkimi metodami se uporabljajo tiste, ki odkrivajo intracelularne virusne vključke v odsekih prizadetih organov in tkiv. Odkrivanje vključkov kaže na okužbo in v nekaterih primerih prispeva k diagnozi virusna bolezen. Različne se uporabljajo za odkrivanje virusnih protiteles v krvi bolnikov in za preučevanje antigenske strukture virusov. Reakcija nevtralizacije se uporablja pri skoraj vseh virusnih okužbah. Temelji na sposobnosti imunskih protiteles, da nevtralizirajo nalezljive lastnosti virusov, ko se mešanica vnese v telo dovzetnih živali ali v tkivno kulturo. Za določitev nevtralizacijskega indeksa konstantno dozo seruma mešamo z različnimi razredčinami virusov, za določitev titra protiteles pa različne razredčine seruma s konstantno dozo virusov. Kontrola je okužba živali (ali tkivne kulture) z mešanico virusov z normalnim serumom ali fiziološko raztopino. Reakcija nevtralizacije se izvaja ne le za odkrivanje protiteles, temveč tudi za določanje vrste in vrste virusov.

Reakcija fiksacije komplementa [na primer reakcija Bordet-Giangou (glej)] se uporablja za odkrivanje tako virusnih antigenov kot protiteles. V prvem primeru reakcija vključuje interakcijo znanega imunskega seruma in materiala, v katerem se domneva prisotnost antigenov: krvni serum, nazofaringealni brisi, tkivni izvlečki okuženega organizma. V drugem primeru - znani antigen (diagnostikum) in serum bolnika ali rekonvalescenta.

RSK se uporablja za diagnosticiranje bolezni, ki jih povzročajo virusi gripe, črnih koz, adenovirusi in arbovirusi.

metode za proučevanje biologije virusov in njihovo identifikacijo. V virologiji se široko uporabljajo metode molekularne biologije, s pomočjo katerih je bilo mogoče ugotoviti molekularno strukturo virusnih delcev, metode njihovega prodiranja v celico in značilnosti razmnoževanja virusa, primarna struktura virusne nukleinske kisline in proteini. Razvijajo se metode za določanje zaporedja sestavnih elementov virusnih nukleinskih kislin in beljakovinskih aminokislin. Funkcije nukleinskih kislin in proteinov, ki jih kodirajo, postane mogoče povezati z nukleotidnim zaporedjem in ugotoviti vzroke znotrajceličnih procesov, ki igrajo pomembno vlogo v patogenezi virusne okužbe.

Virološke raziskovalne metode temeljijo tudi na imunoloških procesih (interakcija antigena s protitelesi), biološke lastnosti značilnosti virusa (sposobnost hemaglutinacije, hemolize, encimska aktivnost), značilnosti interakcije virusa z gostiteljsko celico (značilnost citopatskega učinka, tvorba znotrajceličnih vključkov itd.).

V diagnostiki virusne okužbe, pri gojenju, izolaciji in identifikaciji virusov ter pri pridobivanju pripravki cepiva Metoda gojenja tkiv in celic se pogosto uporablja. Uporabljajo se primarne, sekundarne, stabilne kontinuirane in diploidne celične kulture. Primarne kulture dobimo z dispergiranjem tkiva s proteolitičnimi encimi (tripsin, kolagenaza). Vir celic so lahko tkiva in organi (običajno ledvice) človeških in živalskih zarodkov. Suspenzijo celic v hranilnem mediju namestimo v tako imenovane vzmetnice, stekleničke ali petrijevke, kjer se celice po pritrditvi na površino posode začnejo razmnoževati. Za virusno okužbo se običajno uporablja celični monosloj. Hranilno tekočino odlijemo, dodamo virusno suspenzijo v določenih razredčinah in po stiku s celicami dodamo svež hranilni medij, običajno brez seruma.

Celice večine primarnih kultur lahko subkulturiramo; takšno kulturo imenujemo sekundarna kultura. Z nadaljnjim prehodom celic nastane populacija fibroblastom podobnih celic, ki so sposobne hitrega razmnoževanja, večina pa ohrani prvotni nabor kromosomov. To so tako imenovane diploidne celice. S serijskim gojenjem celic dobimo stabilne kontinuirane celične kulture. Med prehodi se pojavijo hitro deleče se homogene celice s heteroploidnim naborom kromosomov. Stabilne celične linije so lahko enoslojne ali suspenzijske. Enoplastne kulture rastejo v obliki neprekinjenega sloja na površini stekla, suspenzijske kulture rastejo v obliki suspenzij v različna plovila z uporabo mešalnih naprav. Obstaja več kot 400 celičnih linij, pridobljenih iz 40 različne vrsteživali (vključno s primati, pticami, plazilci, dvoživkami, ribami, žuželkami) in ljudje.

V umetnem hranilni mediji lahko gojimo koščke posameznih organov in tkiv (organske kulture). Tovrstne kulture ohranjajo tkivno strukturo, kar je še posebej pomembno za izolacijo in prehod virusov, ki se v nediferenciranih tkivnih kulturah ne razmnožujejo (na primer koronavirusi).

Pri okuženih celične kulture viruse lahko odkrijemo s spremembami morfologije celic, citopatskimi učinki, ki so lahko specifični, pojavom vključkov, z določanjem virusnih antigenov v celici in v kulturi; ugotavljanje bioloških lastnosti virusnih potomcev v kulturni tekočini in titriranje virusov v tkivni kulturi, piščančjih zarodkih ali občutljivih živalih; z identifikacijo posameznih virusnih nukleinskih kislin v celicah z molekularno hibridizacijo ali akumulacijami nukleinskih kislin s citokemično metodo s fluorescentno mikroskopijo.

Izolacija virusov je delovno intenziven in dolgotrajen proces. Izvaja se za določitev tipa ali različice virusa, ki kroži med populacijo (na primer za identifikacijo serovariant virusa gripe, divjega ali cepnega seva virusa otroške paralize itd.); v primerih, ko je treba izvesti nujne epidemiološke ukrepe; ko se pojavijo nove vrste ali različice virusov; če je potrebno, potrdite predhodno diagnozo; za indikacijo virusov v okoljskih predmetih. Pri izolaciji virusov se upošteva možnost njihove obstojnosti v človeškem telesu, pa tudi pojav mešane okužbe, ki jo povzročata dva ali več virusov. Genetsko homogeno populacijo virusa, pridobljeno iz enega viriona, imenujemo virusni klon, postopek pridobivanja pa kloniranje.

Za izolacijo virusov se uporablja okužba dovzetnih laboratorijskih živali in piščančjih zarodkov, najpogosteje pa se uporablja tkivna kultura. Prisotnost virusa se običajno določi s specifično celično degeneracijo (citopatski učinek), tvorbo simplastov in sincitijev, detekcijo znotrajceličnih vključkov, pa tudi s specifičnim antigenom, odkritim z imunofluorescenco, hemadsorpcijo, hemaglutinacijo (za hemaglutinirajoče viruse) itd. . Te znake je mogoče odkriti šele po 2-3 prehodih virusa.

Za izolacijo številnih virusov, kot so virusi gripe, uporabljajo piščančji zarodki, za izolacijo nekaterih virusov Coxsackie in številnih arbovirusov - novorojenih miši. Identifikacija izoliranih virusov se izvaja s serološkimi reakcijami in drugimi metodami.

Pri delu z virusi se določi njihov titer. Titracija virusov se običajno izvaja v tkivni kulturi, pri čemer se določi največja razredčitev tekočine, ki vsebuje virus, pri kateri pride do degeneracije tkiva, nastanejo vključki in virusno specifični antigeni. Metodo s plaki lahko uporabimo za titriranje številnih virusov. Plaki ali negativne kolonije virusov so žarišča celic, ki jih virus uniči v enoslojni tkivni kulturi pod agarsko prevleko. Štetje kolonij omogoča kvantitativno analizo infekcijske aktivnosti virusov na podlagi tega, da en delec kužnega virusa tvori en plak. Plake odkrijemo z barvanjem kulture z intravitalnimi barvili, običajno nevtralno rdečimi; plaki ne absorbirajo barvila in so zato vidni kot svetle lise na ozadju obarvanih živih celic. Titer virusa je izražen kot število enot, ki tvorijo plak, na 1 ml.

Čiščenje in koncentracija virusov se običajno izvede z diferencialnim ultracentrifugiranjem, ki mu sledi koncentracijsko ali centrifugiranje z gradientom gostote. Za čiščenje virusov se uporabljajo imunološke metode, ionsko izmenjevalna kromatografija, imunosorbenti itd.

Laboratorijska diagnostika virusnih okužb vključuje odkrivanje patogena ali njegovih sestavin v kliničnem materialu; izolacijo virusa iz tega materiala; serodiagnoza. Izbira laboratorijske diagnostične metode je v vsakem posameznem primeru odvisna od narave bolezni, obdobja bolezni in zmogljivosti laboratorija. Sodobna diagnostika virusnih okužb temelji na hitrih metodah, ki omogočajo pridobitev odgovora v nekaj urah po odvzemu kliničnega materiala. zgodnji datumi po bolezni, Sem spadajo elektronska in imunska elektronska mikroskopija, pa tudi imunofluorescenca, metoda molekularne hibridizacije, odkrivanje protiteles razreda IgM itd.

Elektronska mikroskopija negativno obarvanih virusov omogoča razlikovanje virusov in določanje njihove koncentracije. Uporaba elektronske mikroskopije pri diagnostiki virusnih okužb je omejena na tiste primere, kjer je koncentracija virusnih delcev v kliničnem materialu precej visoka (10 5 v 1). ml in zgoraj). Pomanjkljivost metode je nezmožnost razlikovanja virusov, ki pripadajo isti taksonomski skupini. To pomanjkljivost odpravimo z uporabo imunske elektronske mikroskopije. Metoda temelji na tvorbi imunskih kompleksov z dodajanjem specifičnega seruma virusnim delcem ob hkratni koncentraciji virusnih delcev, kar omogoča njihovo identifikacijo. Metoda se uporablja tudi za odkrivanje protiteles. Za ekspresne diagnostične namene se izvaja elektronsko mikroskopski pregled tkivnih izvlečkov, blata, tekočine iz veziklov in izločkov iz nazofarinksa. Elektronska mikroskopija ki se pogosto uporablja za preučevanje morfogeneze virusa, se njegove zmogljivosti razširijo z uporabo označenih protiteles.

Metoda molekularne hibridizacije, ki temelji na detekciji virusno specifičnih nukleinskih kislin, omogoča detekcijo posameznih kopij genov in ji ni para v občutljivosti. Reakcija temelji na hibridizaciji komplementarnih DNK ali RNK verig (sond) in nastanku dvoverižnih struktur. Najcenejša sonda je klonirana rekombinantna DNK. Sonda je označena z radioaktivnimi prekurzorji (običajno radioaktivnim fosforjem). Obetavna je uporaba kolorimetričnih reakcij. Obstaja več možnosti za molekularno hibridizacijo: točkovna hibridizacija, blot hibridizacija, sendvič hibridizacija, in situ hibridizacija itd.

Protitelesa razreda IgM se pojavijo prej kot protitelesa razreda G (3.-5. dan bolezni) in izginejo po nekaj tednih, zato njihovo odkrivanje kaže na. okužba v preteklosti. Protitelesa razreda lgM odkrijemo z imunofluorescenco ali z encimskim imunotestom z uporabo anti-μ antiserumov (serumi proti težkim verigam lgM).

Serološke metode v virologiji temeljijo na klasičnih imunoloških reakcijah (glej. Imunološke metode raziskovanje) : reakcije vezave komplementa, inhibicija hemaglutinacije, biološka nevtralizacija, imunodifuzija, indirektna hemaglutinacija, radialna hemoliza, imunofluorescenca, encimski imunski test, radioimunski test. Razvite so bile mikrometode za številne reakcije, njihove tehnike pa se nenehno izboljšujejo. Te metode se uporabljajo za identifikacijo virusov z uporabo niza znanih serumov in za serodiagnostiko za določitev povečanja protiteles v drugem serumu v primerjavi s prvim (prvi serum se vzame v prvih dneh po bolezni, drugi - po 2- 3 tedne). Diagnostična vrednost ima vsaj štirikratno povečanje protiteles v drugem serumu. Če odkrivanje protiteles razreda IgM kaže na nedavno okužbo, potem protitelesa razreda IgC vztrajajo več let, včasih pa celo življenje.

Za identifikacijo posameznih antigenov virusov in protiteles proti njim v kompleksnih mešanicah brez predhodnega čiščenja beljakovin se uporablja imunobloting. Metoda združuje frakcioniranje beljakovin z uporabo elektroforeze v poliakrilamidnem gelu s kasnejšo imunoindikacijo beljakovin metoda encimskega imunskega testa. Ločevanje proteinov zmanjša zahteve po kemični čistosti antigena in omogoča detekcijo posamezni pari antigen – protitelo. Ta naloga je pomembna na primer pri serodiagnostiki okužbe s HIV, kjer so lažno pozitivne reakcije encimskega imunskega testa posledica prisotnosti protiteles proti celičnim antigenom, ki so prisotna zaradi nezadostnega čiščenja virusnih proteinov. Identifikacija protiteles v bolnikovih serumih proti notranjim in zunanjim virusnim antigenom omogoča določitev stadija bolezni, pri analizi populacij pa variabilnost virusnih proteinov. Imunobloting za okužbo s HIV se uporablja kot potrditveni test za identifikacijo posameznih virusnih antigenov in protiteles proti njim. Pri analizi populacij se metoda uporablja za ugotavljanje variabilnosti virusnih proteinov. Velika vrednost metode je v možnosti analize antigenov, sintetiziranih s tehnologijo rekombinantna DNA, ugotavljanje njihove velikosti in prisotnosti antigenskih determinant.

20) Glavna strukturna komponenta virionov(kompletni virusni delci) je nukleokapsida, tj. proteinski ohišje (kapsida), ki vsebuje virusni genom (DNA ali RNA). Nukleokapsida večine virusnih družin je obdana z lipoproteinsko ovojnico. Med ovojnico in nukleokapsido nekaterih virusov (orto-, paramikso-, rabdo-, filo- in retrovirusi) je neglikoziliran matrični protein, ki daje virionom dodatno togost. Virusi večine družin imajo ovojnico, ki ima pomembno vlogo pri kužnosti. Virioni dobijo svojo zunanjo lupino, ko nukleokapsid z brstenjem prodre skozi celično membrano. Beljakovine ovojnice kodira virus, lipide pa vzamejo iz celične membrane. Glikoproteini običajno v obliki dimerov in trimerjev tvorijo peplomerje (izrastke) na površini virionov (orto-, paramiksovirusi, rabdo-, filo-, korona-, bunya-, arena-, retrovirusi). Glikozilirani fuzijski proteini so povezani s peplomeri in igrajo ključno vlogo pri vstopu virusa v celico. Virionske kapside in ovojnice tvorijo več kopij ene ali več vrst beljakovinskih podenot skozi proces samosestavljanja. Interakcija v sistemu protein-protein zaradi šibke kemične vezi, vodi do povezave simetričnih kapsid. Razlike med virusi v obliki in velikosti virionov so odvisne od oblike, velikosti in števila strukturnih beljakovinskih podenot ter narave interakcije med njimi. Kapsida je sestavljena iz številnih morfološko ločenih podenot (kapsomer), sestavljenih iz virusnih polipeptidov na strogo določen način, v skladu z relativno preprostimi geometrijskimi principi. Proteinske podenote, ki se povezujejo med seboj, tvorijo kapside dveh vrst simetrije: izometrične in spiralne. Struktura nukleokapside virusov z ovojnico je podobna zgradbi nukleokapside virusov brez ovojnice. Na površini lupine virusa se razlikujejo morfološko izražene glikoproteinske strukture - peplomeri. Sestava superkapsidne lupine vključuje lipide (do 20-35%) in ogljikove hidrate (do 7-8%) celičnega izvora. Sestavljen je iz dvojne plasti celičnih lipidov in virusno specifičnih proteinov, ki se nahajajo zunaj in znotraj lipidne bioplasti. Zunanjo plast superkapsidne lupine predstavljajo peplomeri (izrastki) ene ali več vrst, sestavljeni iz ene ali več glikoproteinskih molekul. Nukleokapsido virusov z ovojnico pogosto imenujemo jedro, osrednji del virionov, ki vsebuje nukleinsko kislino, pa nukleoid. Kapsomeri (peplomeri) so sestavljeni iz strukturne enote, zgrajena iz ene ali več homolognih ali heterolognih polipeptidnih verig (proteinskih podenot). klasifikacija virusov Izometrične kapside niso krogle, temveč pravilni poliedri (ikozaedri). Njihove linearne dimenzije so enake vzdolž simetrijskih osi. Po Kasparju in Klugu (1962) so kapsomeri v kapsidah razporejeni po ikozaedrski simetriji. Takšne kapside so sestavljene iz enakih podenot, ki tvorijo ikozaeder. Imajo 12 oglišč (kotov), 30 ploskev in 20 ploskev v obliki enakokrakih trikotnikov. V skladu s tem pravilom kapsido poliovirusa in virusa slinavke in parkljevke tvori 60 proteinskih strukturnih enot, od katerih je vsaka sestavljena iz štirih polipeptidnih verig. Ikozaeder optimalno rešuje problem pakiranja ponavljajočih se podenot v strogo kompaktno strukturo z minimalna glasnost. Le določene konfiguracije strukturnih podenot lahko tvorijo površine in tvorijo oglišča in ploskve virusnega ikozaedra. Na primer, strukturne podenote adenovirusa tvorijo heksagonalne kapsomere (heksone) na površinah in robovih ter pentaedrske kapsomere (peptone) na vrhovih. Pri nekaterih virusih obe vrsti kapsomer tvorijo isti polipeptidi, pri drugih - različni polipeptidi. Ker se strukturne podenote različnih virusov med seboj razlikujejo, so nekateri virusi videti bolj heksagonalni, drugi bolj sferični. Vsi znani virusi vretenčarjev, ki vsebujejo DNK, razen virusov črnih koz, kot tudi številni virusi, ki vsebujejo RNK (7 družin), imajo kubično vrsto simetrije kapside. Reovirusi imajo za razliko od drugih vretenčarskih virusov dvojno kapsido (zunanjo in notranjo), od katerih je vsaka sestavljena iz morfoloških enot. Virusi s vijačno simetrijo imajo videz valjaste nitaste strukture, njihova genomska RNA ima obliko vijačnice in se nahaja znotraj kapside. Vsi živalski virusi spiralne simetrije so obdani z lipoproteinsko ovojnico. Za spiralne nukleokapside so značilni dolžina, premer, korak vijačnice in število kapsomer na zavoj vijačnice. Tako je pri virusu Sendai (paramiksovirus) nukleokapsida vijačnica dolžine približno 1 μm, premera 20 nm in koraka 5 nm. Kapsida je sestavljena iz približno 2400 strukturnih enot, od katerih je vsaka beljakovina z molekulsko maso 60 kDa. Za vsak obrat vijačnice je 11-13 podenot. Pri virusih s vijačnim tipom nukleokapsidne simetrije zvijanje beljakovinskih molekul v vijačnico zagotavlja maksimalno interakcijo med nukleinsko kislino in beljakovinskimi podenotami. Pri ikozaedričnih virusih je nukleinska kislina zvita znotraj virionov in sodeluje z enim ali več polipeptidi, ki se nahajajo znotraj kapside.

Antireceptorji (receptorji) Virusni- površinske virionske beljakovine, na primer hemaglutinin, ki se komplementarno vežejo na ustrezen receptor dovzetne celice.

21) Imunološke metode v viroloških študijah.

Serološki testi se razlikujejo po sposobnosti odkrivanja posameznih razredov protiteles. Aglutinacijski test na primer dobro odkrije protitelesa IgG, vendar je manj občutljiv za odkrivanje protiteles IgG. Reakcij vezave komplementa in hemolize, ki zahtevajo komplement, ne zaznajo protitelesa, ki ne vežejo komplementa, kot so protitelesa IgA in protitelesa IgE. Reakcija nevtralizacije virusa vključuje samo protitelesa, usmerjena proti antigenskim determinantam površine viriona, ki so povezane s patogenostjo. Občutljivost I. m. presega vse druge metode za preučevanje antigenov in protiteles; zlasti radioimunski in encimski imunski testi omogočajo odkrivanje prisotnosti beljakovin v količinah, ki se merijo v nanogramih in celo pikogramih. S pomočjo I. m. določite skupino in preverite varnost krvi (hepatitis B in okužba s HIV). Pri presaditvi tkiv in organov se I. m. omogočajo določitev združljivosti tkiv in preskusne metode za zatiranje nezdružljivosti. V sodni medicini se za določanje vrstne specifičnosti proteina uporablja Castellanijeva reakcija, za določanje krvne skupine pa reakcija aglutinacije.

Imunološke metode se pogosto uporabljajo pri laboratorijski diagnostiki nalezljivih bolezni. Etiologijo bolezni ugotavljamo tudi na podlagi povečanja protiteles proti povzročitelju v krvnem serumu rekonvalescenta v primerjavi z vzorcem, odvzetim v prvih dneh bolezni. Na podlagi I. m. preučiti odpornost prebivalstva na množične okužbe, kot je gripa, in tudi oceniti učinkovitost preventivnih cepljenj.

Glede na njihov mehanizem in ob upoštevanju rezultatov I. m. lahko razdelimo na reakcije, ki temeljijo na pojavu aglutinacije; reakcije, ki temeljijo na pojavu padavin; reakcije, ki vključujejo komplement; reakcija nevtralizacije; reakcije z uporabo kemičnih in fizikalnih metod.

Reakcije, ki temeljijo na pojavu aglutinacije. Aglutinacija je lepljenje celic ali posameznih delcev, ki nosijo antigen, s pomočjo imunskega seruma na ta antigen.

Reakcija bakterijske aglutinacije z ustreznim antibakterijskim serumom je ena najpreprostejših seroloških reakcij. Različnim razredčinam krvnega seruma dodamo suspenzijo bakterij in po določenem kontaktnem času pri t°37° zabeležimo, pri kateri največji razredčini krvnega seruma pride do aglutinacije. Reakcija bakterijske aglutinacije se uporablja za diagnosticiranje številnih nalezljivih bolezni: bruceloze, tularemije, tifusa in paratifusa, bacilarne dizenterije, tifusa.

Pasivna ali posredna reakcija hemaglutinacije (RPHA, RNHA). Uporablja rdeče krvne celice ali nevtralne sintetični materiali(na primer delci lateksa), na površini katerih so sorbirani antigeni (bakterijski, virusni, tkivni) ali protitelesa. Do njihove aglutinacije pride, ko dodamo ustrezne serume ali antigene.

Reakcija pasivna hemaglutinacija uporablja se za diagnosticiranje bolezni, ki jih povzročajo bakterije (tifus in paratifus, dizenterija, bruceloza, kuga, kolera itd.), protozoji (malarija) in virusi (gripa, adenovirusne okužbe, virusni hepatitis B, ošpice, encefalitis, ki se prenaša s klopi, krimska hemoragična mrzlica itd.), pa tudi za določanje nekaterih hormonov, prepoznavanje preobčutljivost potrpežljiv do zdravila in hormoni, kot sta penicilin in insulin.

Reakcija inhibicije hemaglutinacije (HAI) temelji na pojavu imunskega seruma, ki preprečuje (zavira) hemaglutinacijo eritrocitov z virusi in se uporablja za odkrivanje in titriranje protivirusnih protiteles. Služi kot glavna metoda za serodiagnostiko gripe, ošpic, rdečk, mumps, klopni encefalitis in druge virusne okužbe, katerih povzročitelji imajo hemaglutinacijske lastnosti. na primer, za serodiagnozo encefalitisa, ki se prenaša s klopi, se v vdolbinice plošče vlije dvakratna razredčina bolnikovega seruma v raztopini alkalnega boratnega pufra. Nato dodamo določeno količino, običajno 8 AU (aglutinacijskih enot), antigena klopnega encefalitisa in po 18 urah izpostavljenosti pri t°4° dodamo suspenzijo gosjih rdečih krvničk, pripravljeno v kisli raztopini s fosfatnim pufrom. . Če bolnikov krvni serum vsebuje protitelesa proti virusu encefalitisa, ki se prenaša s klopi, se antigen nevtralizira in ne pride do aglutinacije rdečih krvnih celic.

Reakcije, ki temeljijo na pojavu padavin. Precipitacija se pojavi kot posledica interakcije protiteles s topnimi antigeni. Najenostavnejši primer precipitacijske reakcije je nastanek v epruveti neprozornega precipitacijskega pasu na meji plasti antigena na protitelesu. Široko se uporabljajo različne vrste reakcij obarjanja v poltekočem agarju ali agaroznem gelu (metoda dvojne imunodifuzije po Ouchterlohnu, metoda radialne imunodifuzije, imunoeletroforeza), ki so tako kvalitativne kot kvantitativne narave. Zaradi proste difuzije antigenov in protiteles v gelu v območju njihovega optimalnega razmerja nastanejo specifični kompleksi - precipitacijski pasovi, ki jih zaznamo vizualno ali z barvanjem. Posebnost metode je, da vsak par antigen-protitelo tvori svoj precipitacijski pas, reakcija pa ni odvisna od prisotnosti drugih antigenov in protiteles v proučevanem sistemu.

Reakcije, ki vključujejo komplement, ki se uporablja kot svež krvni serum morski prašiček, temeljijo na sposobnosti podkomponente komplementa Clq in nato drugih komponent komplementa, da se vežejo na imunske komplekse.

Reakcija fiksacije komplementa (CFR) omogoča titracijo antigenov ali protiteles glede na stopnjo fiksacije komplementa s kompleksom antigen-protitelo. Ta reakcija je sestavljena iz dveh faz: interakcije antigena s preizkušanim krvnim serumom (testni sistem) in interakcije hemolitičnega seruma z ovčjimi rdečimi krvnimi celicami (indikatorski sistem). pri pozitivna reakcija V proučevanem sistemu pride do fiksacije komplementa, nato pa z dodatkom eritrocitov, senzibiliziranih s protitelesi, hemolize ni opaziti. Reakcija se uporablja za serodiagnostiko sifilisa (Wassermannova reakcija), virusnega in bakterijske okužbe.

Nevtralizacijska reakcija temelji na sposobnosti protiteles, da nevtralizirajo določene specifične funkcije makromolekularnih ali topnih antigenov, na primer encimsko aktivnost, bakterijske toksine in virusno patogenost. Reakcijo nevtralizacije toksina lahko ocenimo z biološkim učinkom, na primer titriramo antitetanusne in antibotulinske serume. Mešanica toksina in antiseruma, ki se daje živalim, ne povzroči njihove smrti. V virologiji se uporabljajo različne različice reakcije nevtralizacije. Z mešanjem virusov z ustreznim antiserumom in vnosom te mešanice v živali ali v celične kulture se nevtralizira patogenost virusov in živali ne zbolijo, celice kultur pa se ne uničijo.

Reakcije z uporabo kemičnih in fizikalnih oznak. Imunofluorescenca vključuje uporabo s fluorokromom označenih protiteles, natančneje imunoglobulinske frakcije protiteles IgG. Protitelo, označeno s fluorokromom, tvori kompleks antigen-protitelo z antigenom, ki postane dostopen za opazovanje pod mikroskopom v UV žarkih, ki vzbujajo fluorokrom. Neposredna imunofluorescenčna reakcija se uporablja za preučevanje celičnih antigenov, odkrivanje virusa v okuženih celicah ter odkrivanje bakterij in rikecij v brisih.

Metoda indirektne imunofluorescence je bolj razširjena. temelji na odkrivanju kompleksa antigen-protitelo z uporabo luminescentnega imunskega seruma proti protitelesom IgG in se uporablja za odkrivanje ne le antigenov, ampak tudi titriranje protiteles.

Imunoencimske ali encimsko-imunološke metode temeljijo na uporabi protiteles, konjugiranih z encimi, predvsem hrenovo peroksidazo ali alkalno fosfatazo. Podobno kot imunofluorescenca se metoda encimskega imunskega testa uporablja za odkrivanje antigenov v celicah ali titriranje protiteles na celicah, ki vsebujejo antigen.

Radioimunološka metoda temelji na uporabi radioizotopskih oznak antigenov ali protiteles. Je najobčutljivejša metoda za določanje antigenov in protiteles, uporablja se za določanje hormonov, zdravil in antibiotikov, za diagnosticiranje bakterijskih, virusnih, rikecioznih, protozojskih bolezni, za preučevanje krvnih beljakovin in tkivnih antigenov.

Imunobloting se uporablja za odkrivanje protiteles proti posameznim antigenom ali za "prepoznavanje" antigenov iz znanih serumov. Metoda je sestavljena iz 3 stopenj: ločevanje bioloških makromolekul (npr. virusa) na posamezne proteine z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu; prenos ločenih proteinov iz gela na trdno podlago (blot) s postavitvijo plošče poliakrilamidnega gela na aktiviran papir ali nitrocelulozo (elektroblot); detekcija želenih proteinov na substratu z uporabo neposrednega ali posrednega encimskega imunskega testa. kako diagnostična metoda imunobloting se uporablja za okužbo s HIV. Odkrivanje protiteles proti enemu od proteinov zunanje lupine virusa ima diagnostično vrednost.

22) Vrste simetrije virusov (kubična, spiralna, mešana). Interakcija proteinov in nukleinskih kislin med pakiranjem virusnih genomov.

Glede na interakcijo kapside z nukleinsko kislino lahko virusne delce razdelimo na več vrst simetrije:

1). Kubična vrsta simetrije.

Kubične kapside so ikosiderji s približno 20 trikotnimi površinami in 12 oglišči. Oblikujejo strukturo, ki spominja na sferično tvorbo, v resnici pa gre za polieder. V nekaterih primerih so na oglišča takšnih ikozaedrskih poliedrov pritrjene posebne lipoproteinske tvorbe, imenovane bodice. Vloga teh konic je verjetno zmanjšana na interakcijo virionov ali virusnih delcev z ustreznimi območji gostiteljskih celic, občutljivih nanje. S kubično simetrijo je virusna nukleinska kislina tesno zapakirana (zvita v kroglo), beljakovinske molekule pa jo obdajajo in tvorijo polieder (ikozaeder). Ikozaeder je polieder z dvajsetimi trikotnimi ploskvami, ki ima kubično simetrijo in približno sferično obliko. Ikozaedrični virusi vključujejo virus herpes simplex, reoviruse itd.

2). Spiralna vrsta simetrije. Spiralne kapside so po zgradbi nekoliko enostavnejše. Tisti. Kapsomeri, ki sestavljajo kapsido, pokrivajo spiralno NA in tvorijo tudi dokaj stabilno beljakovinsko lupino teh virusov. In pri uporabi elektronskih mikroskopov visoke ločljivosti in ustreznih metod priprave lahko na virusih vidimo spiralne strukture. S spiralno simetrijo kapside tvori virusna nukleinska kislina spiralno (ali spiralno) figuro, znotraj votlo, okoli nje pa so spiralno razporejene tudi proteinske podenote (kapsomere) (cevasta kapsida). Primer virusa s spiralno kapsidno simetrijo je virus tobačnega mozaika, ki je paličaste oblike in dolg 300 nm s premerom 15 nm. Virusni delec vsebuje eno molekulo RNK, veliko približno 6000 nukleotidov. Kapsida je sestavljena iz 2000 enakih beljakovinskih podenot, razporejenih v spiralo.

3). Mešana ali kompleksna vrsta simetrije. Praviloma se ta vrsta simetrije odkrije predvsem med bakterijskimi virusi. In klasični primeri so ti fagi coli ali zmernih fagov. To so kompleksne formacije, ki imajo glavo z notranjo jedrno vsebino, različne vrste dodatkov, repni proces in naprave različnih stopenj kompleksnosti. In vsaka komponenta takšnih delcev je obdarjena s posebno funkcijo, ki se uresniči med interakcijo virusa s celico. Z drugimi besedami, kompleksna vrsta simetrije je kombinacija kubične simetrije, glava je ikosiderjev polieder in paličaste tvorbe so repni izrastki. Čeprav med bakterijskimi virusi obstajajo tudi precej preprosto organizirani virioni, ki so primitivni nukleokapsidi, sferične ali kubične oblike. Bakterijski virusi so najbolj kompleksni v primerjavi z rastlinskimi in živalskimi virusi.

24) Interakcija faga s celico. Virulentni in zmerni fagi.

Adsorpcija.

Interakcija se začne s pritrditvijo virusnih delcev na celično površino. Proces postane mogoč ob prisotnosti ustreznih receptorjev na površini celice in antireceptorjev na površini virusnega delca.

Virusi uporabljajo celične receptorje, namenjene transportu potrebne snovi: hranilni delci, hormoni, rastni faktorji itd.

Receptorji: beljakovine, ogljikohidratna komponenta beljakovin in lipidov, lipidi. Specifični receptorji določajo nadaljnjo usodo virusnega delca (transport, dostava v področja citoplazme ali jedra). Virus se lahko veže tudi na nespecifične receptorje in celo prodre v celico. Vendar ta proces ne povzroča razvoja okužbe.

Najprej nastane enojna vez med antireceptorjem in receptorjem. Takšna povezava je krhka in se lahko prekine. Za nastanek ireverzibilne adsorpcije je potrebna večvalentna pritrditev. Stabilna vezava nastane zaradi prostega gibanja receptorskih molekul v membrani. Ko virus medsebojno deluje s celico, opazimo povečanje fluidnosti lipidov in nastanek receptorskih polj v območju interakcije med virusom in celico. Receptorji za nekatere viruse so lahko prisotni le v omejenem nizu gostiteljskih celic. To določa občutljivost telesa na ta virus. Tako lahko virusna DNA in RNA okužita širši spekter gostiteljskih celic.

Antireceptorje lahko najdemo v edinstvenih virusnih organelih: prirastnih strukturah pri T-bakteriofagih, vlaknih pri adenovirusih, konicah na površini virusnih membran, koroni pri koronavirusih.

Penetracija.

2 mehanizma – receptorska endocitoza in membranska fuzija.

Receptorska endocitoza:

Običajni mehanizem za vstop hranilnih in regulatornih snovi v celico. Pojavlja se na specializiranih območjih - kjer so posebne jamice, prekrite s klatrinom, so specifični receptorji. Jamice zagotavljajo hitro invaginacijo in nastanek vakuol, obloženih s klatrinom (od trenutka adsorpcije ne mine več kot 10 minut; v eni minuti lahko nastane do 2000 vakuol). Vakuole se združijo z večjimi citoplazemskimi vakuolami in tvorijo receptorosome (ki ne vsebujejo več klatrina), ti pa se združijo z lizosomi.

Fuzija virusnih in celičnih membran:

Pri virusih z ovojnico fuzijo povzročijo točkovne interakcije virusnega proteina z lipidi celične membrane, zaradi česar se virusna lipoproteinska ovojnica integrira s celično membrano. Pri virusih brez ovojnice eden od površinskih proteinov interagira tudi z lipidi celičnih membran in notranja komponenta prehaja skozi membrano (pri paramiksovirusih je to protein F, pri ortomiksovirusih pa hemaglutinacijska podenota HA2). Na konformacijo površinskih proteinov vpliva pH.

Strip.

Med tem procesom infekcijska aktivnost izgine, pogosto se pojavi občutljivost na nukleaze in nastane odpornost proti protitelesom. Končni produkt slačenja so nukleinske kisline, vezane na notranji virusni protein. Faza slačenja tudi omeji možnost okužbe (virusi se ne morejo sleči v vsaki celici). Slačenje poteka v specializiranih predelih celice: lizosomi, Golgijev aparat, perinuklearni prostor.

Slačenje se pojavi kot posledica številnih reakcij. Na primer, pri pikornavirusih pride do slačenja s tvorbo vmesnih subvirusnih delcev velikosti od 156 do 12S. Pri adenovirusih v citoplazmi in jedrskih porah in ima vsaj 3 stopnje:

Tvorba subvirusnih delcev z večjo gostoto kot virioni;

Tvorba jeder brez 3 virusnih proteinov;

Tvorba kompleksa DNA-protein, v katerem je DNA kovaletno povezana s končnim proteinom.

Značilnosti virulentnih in zmernih fagov.

Ko je bakterija okužena s fagom, pride do tako imenovane litične okužbe, to je okužbe, ki se konča z lizo gostiteljske celice, vendar je to značilno le za tako imenovane virulentne fage, katerih interakcija s celico vodi v celično smrt in nastanek fagnega potomstva.

V tem primeru ločimo naslednje stopnje glede na interakcije faga s celico: mešanje faga s celično kulturo (množica okužbe je 1 fag na 10 celic), koncentracija pa mora biti dovolj visoka, da omogoči fagom za stik s celicami. Da bi se izognili ponovni okužbi - po okužbi največ 5 minut, ko se fagi adsorbirajo - se ta mešanica celic s fagom razredči. Obstaja latentno obdobje, v katerem se število fagov ne poveča, nato zelo kratko obdobje sproščanja, ko se število fagnih delcev močno poveča, ko se celica lizira in se sprosti potomstvo fagov, nato pa število fagov ostane na isti ravni, ker do ponovne okužbe ne pride. Na podlagi te krivulje lahko ločimo naslednje faze: vegetativno obdobje »rasti« (latentno obdobje), obdobje sproščanja in izračunamo donos fagov na 1 okuženo celico. V latentnem obdobju v bakterijah ni mogoče odkriti česa podobnega fagnim delcem in iz takih celic v latentnem obdobju ni mogoče izolirati infekcijskega principa. Samo zreli delci faga lahko povzročijo okužbo bakterij. Tako virulentni fagi vedno povzročijo smrt bakterij in povzročijo okužbo, ki se pokaže v nastajanju novih virusnih delcev, ki lahko okužijo naslednje in druge nanje občutljive celice.

Za razliko od virulentnih okužba z zmernimi fagi ne vodi do lize bakterijskih celic, temveč do nastanka poseben pogoj soobstoj faga z bakterijsko celico. To sožitje se izraža v dejstvu, da je določen začetek faga prisoten v bakterijski celici brez zanj neugodnih pogojev in se ohranja iz generacije v generacijo. Na določenih stopnjah takšnega sobivanja se fag v celici aktivira in preide v stanje litičnega razvojnega cikla, kar povzroči lizo celice in sproščanje fagnega potomstva. Takšni fagi se imenujejo lizogeni ali zmerni fagi, stanje zmernega obstoja s fagom pa je lizogenija, bakterije, ki vsebujejo tak skriti fag, pa so lizogene bakterije. Izraz lizogene bakterije je izhajal iz dejstva, da so nekoč odkrili kulture, v katerih se je spontano pojavil fag, ta bakteriofag pa so začeli obravnavati kot kontaminacijo kulture, to je, da bakterijski virus vstopi v kulturo, in takšne kulture so imenovali lizogene, to pomeni, da ustvarjajo lizo.

Virološke raziskovalne metode

metode za proučevanje biologije virusov in njihovo identifikacijo. V virologiji se široko uporabljajo metode molekularne biologije, s pomočjo katerih je bilo mogoče določiti molekularno strukturo virusnih delcev, metode njihovega prodiranja v celico in značilnosti virusne reprodukcije, primarno strukturo virusnih nukleinskih kislin in beljakovin. Razvijajo se metode za določanje zaporedja sestavnih elementov virusnih nukleinskih kislin in beljakovinskih aminokislin. Funkcije nukleinskih kislin in proteinov, ki jih kodirajo, postane mogoče povezati z nukleotidnim zaporedjem in ugotoviti vzroke znotrajceličnih procesov, ki igrajo pomembno vlogo v patogenezi virusne okužbe.

Virološke raziskovalne metode temeljijo tudi na imunoloških procesih (interakcija antigena s protitelesi), bioloških lastnostih virusa (zmožnost hemaglutinacije, hemolize, encimske aktivnosti), značilnostih interakcije virusa z gostiteljsko celico (narava citopatskega učinka , tvorba znotrajceličnih vključkov itd.).

Pri diagnostiki virusnih okužb, pri gojenju, izolaciji in identifikaciji virusov ter pri izdelavi pripravkov cepiva se široko uporablja metoda tkivnih in celičnih kultur. Uporabljajo se primarne, sekundarne, stabilne kontinuirane in diploidne celične kulture. Primarne kulture dobimo z dispergiranjem tkiva s proteolitičnimi encimi (tripsin, kolagenaza). Vir celic so lahko tkiva in organi (običajno ledvice) človeških in živalskih zarodkov. Suspenzijo celic v hranilnem mediju namestimo v tako imenovane vzmetnice, stekleničke ali petrijevke, kjer se celice po pritrditvi na površino posode začnejo razmnoževati. Za virusno okužbo se običajno uporablja celični monosloj. Hranilno tekočino odlijemo, dodamo virusno suspenzijo v določenih razredčinah in po stiku s celicami dodamo svež hranilni medij, običajno brez seruma.

Celice večine primarnih kultur lahko subkulturiramo; takšno kulturo imenujemo sekundarna kultura. Z nadaljnjim prehodom celic nastane populacija fibroblastom podobnih celic, ki so sposobne hitrega razmnoževanja, večina pa ohrani prvotni nabor kromosomov. To so tako imenovane diploidne celice. S serijskim gojenjem celic dobimo stabilne kontinuirane celične kulture. Med prehodi se pojavijo hitro deleče se homogene celice s heteroploidnim naborom kromosomov. Stabilne celične linije so lahko enoslojne ali suspenzijske. Enoslojne kulture rastejo v obliki neprekinjenega sloja na stekleni površini, medtem ko suspenzijske kulture rastejo v obliki suspenzij v različnih posodah z uporabo mešalnih naprav. Obstaja več kot 400 celičnih linij, pridobljenih iz 40 različnih živalskih vrst (vključno s primati, pticami, plazilci, dvoživkami, ribami, žuželkami) in ljudi.

Delčke posameznih organov in tkiv (organske kulture) lahko gojimo v umetnih hranilnih gojiščih. Tovrstne kulture ohranjajo tkivno strukturo, kar je še posebej pomembno za izolacijo in prehod virusov, ki se v nediferenciranih tkivnih kulturah ne razmnožujejo (na primer koronavirusi).

V okuženih celičnih kulturah lahko viruse odkrijemo s spremembami morfologije celic, citopatskimi učinki, ki so lahko specifični, pojavom vključkov, z določanjem virusnih antigenov v celici in v tekočini kulture; ugotavljanje bioloških lastnosti virusnih potomcev v kulturni tekočini in titriranje virusov v tkivni kulturi, piščančjih zarodkih ali občutljivih živalih; z identifikacijo posameznih virusnih nukleinskih kislin v celicah z molekularno hibridizacijo ali akumulacijami nukleinskih kislin s citokemično metodo s fluorescentno mikroskopijo.

Piščančji zarodki se uporabljajo za izolacijo številnih virusov, na primer virusov influence, novorojene miši pa se uporabljajo za izolacijo nekaterih virusov Coxsackie in številnih arbovirusov. Identifikacija izoliranih virusov se izvaja s serološkimi reakcijami in drugimi metodami.

Laboratorijska diagnostika virusnih okužb vključuje odkrivanje patogena ali njegovih sestavin v kliničnem materialu; izolacijo virusa iz tega materiala; serodiagnoza. Izbira laboratorijske diagnostične metode je v vsakem posameznem primeru odvisna od narave bolezni, obdobja bolezni in zmogljivosti laboratorija. Sodobna diagnostika virusnih okužb temelji na ekspresnih metodah, ki omogočajo pridobitev odgovora nekaj ur po odvzemu kliničnega materiala v zgodnjih fazah bolezni. Sem spadajo elektronska in imunska elektronska mikroskopija, pa tudi imunofluorescenca, metoda molekularne hibridizacije. , odkrivanje protiteles razreda IgM itd.

Elektronska mikroskopija negativno obarvanih virusov omogoča razlikovanje virusov in določanje njihove koncentracije. Uporaba elektronske mikroskopije pri diagnostiki virusnih okužb je omejena na tiste primere, kjer je koncentracija virusnih delcev v kliničnem materialu precej visoka (10 5 v 1). ml in zgoraj). Pomanjkljivost metode je nezmožnost razlikovanja virusov, ki pripadajo isti taksonomski skupini. To pomanjkljivost odpravimo z uporabo imunske elektronske mikroskopije. Metoda temelji na tvorbi imunskih kompleksov z dodajanjem specifičnega seruma virusnim delcem ob hkratni koncentraciji virusnih delcev, kar omogoča njihovo identifikacijo. Metoda se uporablja tudi za odkrivanje protiteles. Za ekspresne diagnostične namene se izvaja elektronsko mikroskopski pregled tkivnih izvlečkov, blata, tekočine iz veziklov in izločkov iz nazofarinksa. Elektronska mikroskopija se pogosto uporablja za preučevanje morfogeneze virusa, njene zmožnosti se razširijo z uporabo označenih protiteles.

Protitelesa razreda IgM se pojavijo prej kot protitelesa razreda G (3.-5. dan bolezni) in izginejo po nekaj tednih, zato njihovo odkritje kaže na nedavno okužbo. Protitelesa razreda lgM odkrijemo z imunofluorescenco ali z encimskim imunotestom z uporabo anti-μ antiserumov (serumi proti težkim verigam lgM).

Serološke metode v virologiji temeljijo na klasičnih imunoloških reakcijah (glej Imunološke raziskovalne metode). : reakcije vezave komplementa, inhibicija hemaglutinacije, biološka nevtralizacija, imunodifuzija, indirektna hemaglutinacija, radialna hemoliza, imunofluorescenca, encimski imunski test, radioimunski test. Razvite so bile mikrometode za številne reakcije, njihove tehnike pa se nenehno izboljšujejo. Te metode se uporabljajo za identifikacijo virusov z uporabo niza znanih serumov in za serodiagnostiko za določitev povečanja protiteles v drugem serumu v primerjavi s prvim (prvi serum se vzame v prvih dneh po bolezni, drugi - po 2- 3 tedne). Diagnostična vrednost je nič manj kot štirikratno povečanje protiteles v drugem serumu. Če odkrivanje protiteles razreda IgM kaže na nedavno okužbo, potem protitelesa razreda IgC vztrajajo več let, včasih pa celo življenje.

Za identifikacijo posameznih antigenov virusov in protiteles proti njim v kompleksnih mešanicah brez predhodnega čiščenja beljakovin se uporablja imunobloting. Metoda združuje frakcioniranje proteinov z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu in kasnejšo imunoindikacijo proteinov z metodo encimskega imunskega testa. Ločevanje proteinov zmanjša zahteve po kemijski čistosti antigena in omogoča identifikacijo posameznih parov antigen-protitelo. Ta naloga je pomembna na primer pri serodiagnostiki okužbe s HIV, kjer so lažno pozitivne reakcije encimskega imunskega testa posledica prisotnosti protiteles proti celičnim antigenom, ki so prisotna zaradi nezadostnega čiščenja virusnih proteinov. Identifikacija protiteles v bolnikovih serumih proti notranjim in zunanjim virusnim antigenom omogoča določitev stadija bolezni, pri analizi populacij pa variabilnost virusnih proteinov. Imunobloting za okužbo s HIV se uporablja kot potrditveni test za identifikacijo posameznih virusnih antigenov in protiteles proti njim. Pri analizi populacij se metoda uporablja za ugotavljanje variabilnosti virusnih proteinov. Velika vrednost metode je v možnosti analize antigenov, sintetiziranih s tehnologijo rekombinantne DNK, ugotavljanju njihove velikosti in prisotnosti antigenskih determinant.

MINISTRSTVO ZA IZOBRAŽEVANJE IN ZNANOST RUSKE FEDERACIJE

KABARDINSKO-BALKARSKA DRŽAVA

UNIVERZA poimenovana po. Kh.M.BERBEKOVA

_________________________________________________________________

ZNAČILNOSTI RNA VIRUSA IN DNA VIRUSA

OKUŽBE
Metodološka priporočila za študij teoretičnega gradiva

na tečaju "Zasebna medicinska virologija"

za tuje študente
Za specialnost 060101 – Splošna medicina

Naljčik - 2010

UDK 576.858(075.8)

BBK 52.63ya73

Recenzent:

Kandidat bioloških znanosti, višji predavatelj, Oddelek za mikrobiologijo, higieno in sanitarije, Kabardino-Balkarska država

kmetijska akademija

M.H. Peževa

Sestavila: Blieva Larisa Zaurbekovna

Značilnosti RNA virusnih in DNA virusnih okužb: Metodološka priporočila za študij teoretičnega gradiva pri predmetu "Zasebna medicinska virologija" za tuje študente - Nalchik: Kab.-Balk. univ., 2010.- 48 str.

V metodoloških priporočilih so predstavljeni cilji in cilji posamezne teme, teoretične informacije o zasebni virologiji in zahteve glede stopnje pripravljenosti študentov. Za vsako temo so podana testna vprašanja, situacijske naloge in seznam priporočene literature. Delo vsebuje glosar osnovnih pojmov in definicij v zasebni virologiji.

Publikacija je namenjena tujim študentom, ki študirajo v 3. letniku specialnosti "Splošna medicina".

UDK 576.858(075.8)

BBK 52.63ya73

Kabardino-Balkarian

Državna univerza, 2010

UVOD

Predmet Zasebna medicinska virusologija se izvaja za študente 3. letnika Medicinske fakultete in je sestavni del discipline "Mikrobiologija, virologija, imunologija". Skupna prostornina Medicinski virologiji je namenjenih 184 učnih ur, od tega 2 uri predavanj in 3 ure laboratorijskih vaj. Te smernice so bile razvite glede na teme, pomembne za laboratorijsko delo. Obstoječa laboratorijska delavnica ne vsebuje vsega potrebnega gradiva za obvladovanje teh vsebin.

Tuji študenti težko obvladajo veliko količino informacij v treh laboratorijskih urah. Avtorju se je zdelo primerno, da v tej publikaciji predstavi kratek opis povzročiteljev virusnih okužb in patogenezo bolezni, ki jih povzročajo.

Za vsako temo je podan seznam kontrolnih vprašanj; situacijske naloge, ki bodo študentom omogočile oceno njihove pripravljenosti na obravnavano temo; seznam priporočene literature.

Referenčni del publikacije vsebuje opis osnovnih pojmov in izrazov, ki se uporabljajo v sodobni virologiji ter strukturo najpogostejših virusov. Abecedni vrstni red predstavitve terminološkega slovarja-priročnika je primeren za uporabo.
TEMA 1. RNK virusi

Tarča– preučevanje strukturnih značilnosti virusov, ki vsebujejo RNA, in patogeneze bolezni, ki jih povzročajo.

Naloge:

1 – poznati sistematski položaj vsakega patogena;

2 – poznati morfologijo in zgradbo patogenov;

3 – preučite patogenezo vseh bolezni, ki jih povzročajo ti patogeni, po načrtu: a) vir okužbe; b) metode okužbe; c) vhodna vrata okužbe; d) stopnje patogeneze;

4 – poznati metode laboratorijske diagnostike bolezni;

5 – pozna specifično preventivo in specifično terapijo;

6 – znati razlikovati med različnimi virusi;

7 – znati rešiti situacijske probleme na temo;

8 – obvladati pripravo situacijskih problemov na temo.
Značilnosti RNA virusov

Lekcija 1

Družina Orthomyxoviridae (iz grškega orthos - ravno, myxa - sluz)

Genus 1 - Influensavirus A, B

Virus gripe A

Virus influence B

Genus 2 - Influensavirus C

Virus gripe tipa C

Značilnosti patogeneze gripe

Vir – bolna oseba, nosilec; Metoda okužbe je v zraku. Inkubacijska doba je 1-3 dni. Prodromalno obdobje je splošno slabo počutje, občutek šibkosti. Glavni simptomi - hiter dvig temperatura do 37,5-38 0 C s spremljajočo mialgijo, izcedek iz nosu, kašelj, glavoboli; Trajanje febrilnega obdobja je 3-5 dni. Virus influence A je nevrotropen, zato je možen razvoj nevrotoksikoze. Razvije se katar zgornjih dihalnih poti (suh kašelj, bolečine v prsih, rinitis). Možna sta hemoragična pljučnica in pljučni edem, kar povzroči hitro smrt. Redkeje in pogosteje se pri otrocih pojavi abdominalni sindrom (bolečine v trebuhu, slabost, bruhanje, driska).

Laboratorijska diagnostika

Hitra diagnostika. Virusne antigene odkrijemo v testnem materialu (izcedek iz nazofarinksa) z uporabo imunofluorescenčne reakcije (RIF) (direktna in indirektna različica) in encimskega imunskega testa (ELISA). Z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) je možno zaznati genom virusov v materialu.

Virološka metoda. Celične kulture HeLa-2 so okužene in mikroskopija v 24 urah razkrije fino žariščno degranulacijo v celični kulturi. Indikacija virusov se izvaja tudi s tvorbo "plakov", "barvnim testom", reakcijo hemaglutinacije in reakcijo hemadsorpcije. Viruse prepoznamo po njihovi antigenski strukturi. Uporabljajo se reakcija vezave komplementa, reakcija inhibicije hemaglutinacije in reakcija biološke nevtralizacije virusov.

Serološki metoda. Diagnozo postavimo s štirikratnim povečanjem titra protiteles v parnih serumih bolnika, pridobljenih v intervalu 10-14 dni. Pri nastavitvi reakcije za nevtralizacijo citopatskega učinka opazimo pozitiven rezultat pri dodajanju seruma tipa A inhibicije hemaglutinacije, reakcije fiksacije komplementa, reakcije imunofluorescence in encimskega imunskega testa. Specifična preventiva – živo oslabljeno cepivo, ubito cepivo, split cepiva, kemično cepivo. Specifična terapija je γ-globulin proti gripi.

Družina Paramyxoviridae (iz latinskega para - približno)

Genus 1 – Respirovirus – virusi parainfluence tipa 1 in 3

Genus 2 – Rubulavirus – virusi mumpsa in parainfluence tipa 2 in 4

Genus 3 – Morbilivirus – virus ošpic

Genus 4 – Pneumovirus – respiratorni sincicijski virus (RS virus)

Značilnosti patogeneze parainfluence

Vir – bolna oseba, nosilec; Metoda okužbe je v zraku. Inkubacijska doba - 3-6 dni; pri odraslih - v obliki katarja zgornji deli dihalni trakt (laringitis); pri otrocih - najpogosteje opazimo simptome zastrupitve z razvojem lažnega krupa; pri otrocih, mlajših od enega leta - bronhiolitis s pljučnico.

Laboratorijska diagnostika

Virološka metoda. Pacientu se vzame sluz ali izcedek iz dihalnih poti in izpljunek, celična kultura pa se okuži. Indikacija se izvaja s citopatskim učinkom virusov in reakcijo hemaglutinacije. Identifikacija se izvede z uporabo reakcije inhibicije hemaglutinacije, reakcije fiksacije komplementa in reakcije nevtralizacije.

Serološka metoda. Za identifikacijo virusnih antigenov in odkrivanje protiteles v seznanjenih krvnih serumih bolnikov se izvajajo reakcija zaviranja hemaglutinacije, reakcija fiksacije komplementa in reakcija nevtralizacije (retrospektivna diagnostika). Specifična preventiva in specifična terapija nista.

Značilnosti patogeneze mumpsa ali "mumpsa"

Vir je bolna oseba; Metoda okužbe je v zraku. Inkubacijska doba je 14-21 dni. Tipična oblika bolezni se kaže kot enostranski ali dvostranski parotitis, ki ga spremlja vročina. Do okužbe parotidne žleze slinavke pride s hematogenim širjenjem virusa, ki se pojavi po 3-5 dneh po pojavu prvih simptomov. Viremija povzroči širjenje virusa po telesu; mogoče serozni meningitis, epididimo-orhitis, kot posledica - neplodnost. Imuniteta je močna.

Laboratorijska diagnostika

Virološki metoda. S testnim materialom (slina, cerebrospinalna tekočina, urin, krvni serum) okužimo celično kulturo piščančjih fibroblastov ali piščančji zarodek. Virus identificiramo z reakcijo inhibicije hemaglutinacije, reakcijo imunofluorescence, reakcijo nevtralizacije in reakcijo fiksacije komplementa.

Serološka metoda. Protitelesa se določijo v parnih bolnikovih serumih z uporabo encimskega imunskega testa, reakcije fiksacije komplementa in reakcije inhibicije hemaglutinacije. Specifična diagnostika – živo cepivo, pridruženo cepivo (proti ošpicam, mumpsu, rdečkam). Specifične terapije ni.

Značilnosti patogeneze ošpic

Vir - bolna oseba (običajno otroci, stari 4-5 let); metode okužbe so v zraku, manj pogosto kontaktne. Inkubacijska doba je 8-15 dni. Akutne respiratorne manifestacije (rinitis, faringitis, konjunktivitis, fotofobija, temperatura 38,8-39 0 C). 3-4 dni se na sluznicah in koži pojavi makulopapulozni izpuščaj: najprej na obrazu, nato na trupu in okončinah. Dan preden se na sluznici lic pojavi izpuščaj, majhne lise, obdan z rdečim halojem. Bolezen traja 7-9 dni, izpuščaj izgine brez sledi. Doživljenjska imunost.

Laboratorijska diagnostika

Virološki metoda. Pregledujejo nazofaringealno izpiranje, ostružke iz elementov izpuščaja, krvi in urina. Virus odkrijejo v patološkem materialu in v okuženih celičnih kulturah z imunofluorescenčno reakcijo, reakcijo inhibicije hemaglutinacije in reakcijo nevtralizacije. Zanj je značilna prisotnost večjedrnih celic in antigenov patogenov v njih.

Serološka metoda. Za serološko diagnozo se uporabljajo reakcija fiksacije komplementa, reakcija inhibicije hemaglutinacije in reakcija nevtralizacije. Specifična preventiva je živo atenuirano cepivo. Specifične terapije ni.

Značilnosti patogeneze bolezni, ki jih povzroča respiratorni sincicijski virus

Vir je bolna oseba; načini okužbe - zračni, kontaktni in gospodinjski. Patogen prodre v epitelne celice zgornjih dihalnih poti, se razmnožuje in povzroči njihovo smrt, patološki proces se razširi na spodnje dihalni trakt, se razvija sekundarna imunska pomanjkljivost, kar vodi do razvoja sekundarnih bakterijskih okužb. Inkubacijska doba je 3-5 dni. Znaki akutnih okužb dihal, nato traheobronhitis, pljučnica. Imuniteta je kratkotrajna, možni so recidivi.

Laboratorijska diagnostika

Virološka metoda. Celične kulture se okužijo s testnim materialom (nazofaringealni izločki, pljučno tkivo). Indikacija virusov se izvaja glede na naravo citopatskega delovanja - tvorbo sincicija in identifikacijo virusov - z uporabo reakcije nevtralizacije, reakcije fiksacije komplementa.

Serološka metoda. Odkrivanje specifičnega antigena se izvaja z imunofluorescenčno reakcijo, encimskim imunskim testom (hitra diagnostika).

Virusoskopska metoda. Mikroskopski (histološki) pregled razkrije večjedrne celice in sincicij v epiteliju bronhialne sluznice. Specifična preventiva in specifična terapija nista.

Varnostna vprašanja:

Virus gripe: taksonomija, struktura, patogeneza bolezni, laboratorijska diagnostika, specifično preventivo in terapijo.
Virus parainfluence: taksonomija, struktura, patogeneza bolezni, laboratorijska diagnostika, specifična preventiva in terapija.
Virus mumpsa: taksonomija, struktura, patogeneza bolezni, laboratorijska diagnostika, specifična preventiva in terapija.
Virus ošpic: taksonomija, struktura, patogeneza bolezni, laboratorijska diagnostika, specifična preventiva in terapija.
Respiratorni sincicijski virus: taksonomija, struktura, patogeneza bolezni, laboratorijska diagnostika, specifična preventiva in terapija.

Situacijske naloge

Material (ostružki iz elementov izpuščaja) smo prejeli od otroka z akutno respiratorne manifestacije, fotofobija, temperatura 38,8-39,0 0 C in makulopapulozni izpuščaj na sluznicah in koži. Ko so bile celične kulture okužene, so bile najdene večjedrne celice. Identificirajte povzročitelja.
Material (izcedek iz nazofarinksa) smo prejeli od otroka z znaki akutne bolezni dihal. Patogen je bil odkrit z virološko metodo. V celični kulturi so opazili tvorbo sincicija. Ugotovite povzročitelja bolezni.

Lekcija 2

družinaPicornaviridae

Genus 1 – Enterovirus – virusi otroške paralize, virusi Coxsackie, virusi ECHO

Značilnosti patogeneze poliomielitisa

Vir je bolna oseba; način okužbe - fekalno-oralni; v zraku; stik. Inkubacijska doba je 7-14 dni. Obstajajo 3 klinične oblike otroške paralize: paralitična, meningealna in neuspešna. Bolezen se začne s povišano telesno temperaturo, splošnim slabim počutjem, glavoboli, bruhanjem in vnetjem grla. Paralitično obliko največkrat povzroči virus otroške paralize serotipa 1. Imunost je doživljenjska.

Laboratorijska diagnostika

Virološka metoda. Material za raziskave so iztrebki, izcedek iz nazofarinksa in v primeru smrti - koščki možganov in hrbtenjače ter bezgavke. Celične kulture so okužene s testnim materialom. Razmnoževanje virusov ocenjujemo po njihovem citopatskem učinku. Izolirani virus se identificira (tipizira) z uporabo tipsko specifičnih serumov v nevtralizacijski reakciji v celični kulturi.

Serološka metoda. Serodiagnoza temelji na uporabi seznanjenih serumov pacientov z uporabo referenčnih virusnih sevov kot diagnostičnega orodja. Vsebnost serumskih imunoglobulinov razredov IgG, IgA, IgM se določi z metodo radialne imunodifuzije po Manciniju. Specifična preventiva je množična imunizacija otrok s peroralnim živim cepivom 3 serotipov. Specifične terapije ni.

Značilnosti patogeneze bolezni, ki jih povzročajo virusi Coxsackie

Vir je bolna oseba; Način okužbe je fekalno-oralni, kontaktni. Okužbe pogosto opazimo pri otrocih. Običajno so opaženi simptomi prehlada ali vročine neznanega izvora. V redkih primerih se razvijejo hude lezije - pemfigus ustne votline in okončin, epidemična plevrodinija, perikarditis in miokarditis. Akutne črevesne virusne bolezni povzročajo samo virusi skupine A.

Laboratorijska diagnostika

Virološka metoda. Material za raziskavo je blato in izcedek iz nazofarinksa. Okužijo kulture celic HeLa ali opičjih ledvic (Coxsackie B, posamezni serotipi Coxsackie A) ali miši dojilje. Upoštevajte značaj patološke spremembe pri okuženih miših. Viruse identificiramo s testom inhibicije hemaglutinacije, testom vezave komplementa, nevtralizacijskim testom in encimskim imunskim testom. Specifična preventiva in specifična terapija nista.

Značilnosti patogeneze bolezni, ki jih povzročajo virusi ECHO

Vir je bolna oseba; Način okužbe je fekalno-oralni, zračni. Virusi povzročajo prehlad nalezljive bolezni, aseptični meningitis, ki je relativno blag, manj pogost ascendentna paraliza in encefalitis, vročinsko stanje, ki ga spremljajo ošpicam podobni izpuščaji.

Laboratorijska diagnostika

Virološka metoda. Virus izoliramo iz cerebrospinalne tekočine, blata in nazofaringealnega izcedka. Celične kulture opičjih ledvic so okužene in identificirane s testom inhibicije hemaglutinacije, testom vezave komplementa, nevtralizacijskim testom in encimskim imunskim testom.

Serološka metoda. Zvišanje titra protiteles se odkrije v krvnem serumu z uporabo reakcije inhibicije hemaglutinacije, reakcije fiksacije komplementa, reakcije nevtralizacije in encimskega imunskega testa. Specifična preventiva in specifična terapija nista.
družinaTogaviridae

Genus 1 – Rubivirus – virus rdečk

Značilnosti patogeneze rdečk

Vir – bolna oseba, nosilec; metode okužbe - v zraku, transplacentalno. Obstajata dve obliki bolezni: 1 - pridobljena. Inkubacijska doba je 11-24 dni. Bolezen se začne z rahlim zvišanjem temperature in blagimi kataralnimi simptomi, konjunktivitisom, pa tudi s povečanjem posteriornih vratnih in okcipitalnih bezgavk. Nato se po telesu pojavi makulopapulozni izpuščaj. Imuniteta je močna.

2 - prirojena - počasna virusna okužba, ki se razvije kot posledica intrauterine transplacentalne okužbe ploda. Za bolezen je značilen razvoj sive mrene, gluhost in srčne napake ter druge razvojne nepravilnosti. Slepota v kombinaciji z gluhostjo in okvaro centralnega živčnega sistema vodi v duševno zaostalost. Imuniteta je neverjetna.

Laboratorijska diagnostika

Virološka metoda. Virus izoliramo iz brisov nosne in žrelne sluznice, krvi, urina, redkeje blata, pa tudi notranji organi mrtvi otroci. S testnim materialom okužimo občutljive celice, viruse pa indiciramo na podlagi interference s citopatogenimi virusi ali z zaznavo citopatskega učinka.

Serološka metoda. Za odkrivanje protiteles se uporabljajo nevtralizacijska reakcija, reakcija fiksacije komplementa, reakcija inhibicije hemaglutinacije in encimski imunski test. Diagnostično pomembno je štirikratno ali večjo rast titrov protiteles v dinamiki bolezni, pa tudi določitev specifičnih IgM, ki kažejo na nedavno bolezen ali bolezen v času pregleda. Specifična preventiva – živo cepivo, pridruženo cepivo. Specifične terapije ni.

Družina Rhabdoviridae

Genus 1 – Lessavirus – virus stekline

Značilnosti patogeneze stekline

Viri - divja steklina - lisice, volkovi, glodavci, netopirji, urbana steklina - psi, mačke; metode okužbe - stik z ugrizi, manj pogosto - s prekomernim slinjenjem poškodovanih integumentov, aerogeno je možno v jamah, ki jih naseljujejo netopirji, včasih prebavni. Virus, ki vstopi v poškodovano zunanjo ovojnico s slino bolne živali, se razmnožuje in vztraja na mestu vnosa. Nato se širi po aksonih perifernih živcev, doseže celice možganov in hrbtenjače, kjer se razmnožuje. Babes-Negrijeva telesca najdemo v citoplazmi možganskih nevronov. Celice se podvržejo degenerativne spremembe. Ko se virus razmnoži, potuje iz možganov prek centrifugalnih nevronov v različna tkiva, vključno z žleze slinavke. Inkubacijska doba je od 10 dni do 3 mesecev, včasih do enega leta. Na začetku bolezni - slabo počutje, strah, tesnoba, nespečnost, nato se razvijejo refleksna razdražljivost in spazmodične kontrakcije mišic žrela in grla. Krči se okrepijo, ko poskušate piti, ob pogledu na točenje vode, zaradi močne svetlobe, hrupa. Razvijejo se halucinacije in na koncu bolezni - paraliza mišic okončin in dihanja. Manj pogosto se bolezen razvije brez vznemirjenosti in hidrofobije; Razvije se paraliza in slinjenje. Smrtnost - 95%. Postinfekcijska imunost ni raziskana.

Laboratorijska diagnostika

Virusoskopska metoda. Posmrtna diagnoza vključuje odkrivanje Babes-Negrijevih teles v brisih prstnih odtisov ali delih možganskega tkiva. Telesca Babes-Negri identificiramo z metodami obarvanja po Romanovsky-Giemsi, Mannu, Turevichu, Muromtsevu itd.

Virološka metoda. Patološki material se injicira intracerebralno v bele miši. Identifikacija virusov poteka z uporabo encimskega imunskega testa, pa tudi z nevtralizacijsko reakcijo pri miših z uporabo imunoglobulina proti steklini za nevtralizacijo virusa.

Serološka metoda. Protitelesa pri bolnikih določamo z reakcijo vezave komplementa in encimskim imunskim testom. Specifična preventiva in terapija – inaktivirano cepivo Fermi, gensko spremenjeno cepivo. Imunizirajte ljudi, ki jih ugriznejo živali, za katere obstaja sum stekline. V tem primeru se v inkubacijskem obdobju oblikuje aktivna imunost. V primeru večkratnih ugrizov se ustvari pasivna imunost z dajanjem imunoglobulina proti steklini.

Družina Retroviridae

Genus 1 – Lentivirus – HIV

Značilnosti patogeneze okužbe s HIV

Vir – bolna oseba, nosilec; metode okužbe - spolne, parenteralne, transplacentalne. Faze okužbe s HIV:

1 – inkubacijska doba – 2-4 tedne;

2 – stopnja primarne manifestacije: akutna vročina, limfadenopatija, driska, stopnja se konča z asimptomatsko fazo, ponovna vzpostavitev dobrega počutja, lahko traja več let;

3 – stopnja sekundarne bolezni ki se kaže v poškodbah dihal, živčni sistemi, prebavila, nastanek maligni tumorji v različnih kombinacijah;

Faza 4 – sam AIDS, za katerega so značilni kaheksija, trdovratna driska, adinamija, anemija, demenca, zmanjšanje vseh imunski indikatorji s smrtnim izidom.

Laboratorijska diagnostika

Serološka metoda. Za potrditev diagnoze določimo protitelesa proti proteinom gp41, gp120, gp160, p24 pri HIV-1 in protitelesa proti proteinom gp36, gp105, gp140 pri HIV-2. Protitelesa proti HIV se pojavijo 2-4 tedne po okužbi in se odkrijejo v vseh fazah okužbe s HIV in aidsa. Pri vsakem pozitivnem testu se za potrditev rezultatov izvede reakcija imunskega blotinga. Uporablja se tudi PCR. Specifična preventiva in specifična terapija nista.

Varnostna vprašanja:

Virus poliomielitisa: taksonomija, struktura, patogeneza bolezni, laboratorijska diagnostika, specifična preventiva in terapija.
Coxsackie virus: taksonomija, struktura, patogeneza bolezni, laboratorijska diagnostika, specifična preventiva in terapija.
Virus ECHO: taksonomija, struktura, patogeneza bolezni, laboratorijska diagnostika, specifična preventiva in terapija.
Virus rdečk: taksonomija, struktura, patogeneza bolezni, laboratorijska diagnostika, specifična preventiva in terapija.
Virus stekline: taksonomija, struktura, patogeneza bolezni, laboratorijska diagnostika, specifična preventiva in terapija.
Virus humane imunske pomanjkljivosti: taksonomija, struktura, patogeneza bolezni, laboratorijska diagnostika, specifična preventiva in terapija.

Situacijske naloge:

Material za raziskavo je bil prejet (izpiranje iz sluznice nosu in žrela) pri otroku z blagimi kataralnimi simptomi in povečano posteriorno vratno in okcipitalno. bezgavke. Okužena je bila celična kultura, v kateri smo po inkubaciji odkrili CPE. Identificirajte povzročitelja.
Material za raziskavo (blato) smo prejeli od otroka z znaki splošne slabosti, glavobola in povišane telesne temperature. Celice so cepili v kulturo, v kateri so po inkubaciji našli virusne delce, odporne na eter. Identificirajte povzročitelja.

Literatura

Velik slovar medicinski izrazi/ Comp. Fedotov V.D. – M.: ZAO Tsentrpoligraf, 2007.
Vorobjov A.A. Medicinska mikrobiologija, virologija in imunologija: učbenik. – M.: MIA, 2004.
Vorobyov A.A., Bykov A.S. Atlas medicinske mikrobiologije, virologije in imunologije. – M.: MIA, 2003.
Vorobyov A.A., Krivoshein Yu.S., Shirobokov V.P. Medicinska in sanitarna mikrobiologija. – M.: ASADEMA, 2003.
Golubev D.B. Vodnik za uporabo celičnih kultur v virologiji. – L., 1986. Elektronski učbenik.
Krasilnikov A.P., Romanovskaya T.R. Mikrobiološki slovar-priročnik./ - 2. izd., dop. in predelano – Mn .: “Asar”, 1999.
Korotyaev A.I., Babichev S.A. Medicinska mikrobiologija, virologija in imunologija: učbenik za med. univerze – 3. izd., prev. in dodatno – Sankt Peterburg: SpetsLit, 2002.
Medicinska mikrobiologija, virologija in imunologija: učbenik / Ed. A.A. Vorobyova - M.: Medicinska informacijska agencija, 2004.
Splošna medicinska virologija / N.S. Gorjačkina in drugi; uredil N.S. Gorjačkina, L.I. Kafarskaja. – Rostov n/d: Phoenix, 2007.
www. okužb.ru/rus/all/mv b revije.shtml

Virološke raziskovalne metode

V okuženih celičnih kulturah ga lahko odkrijemo s spremembami morfologije celic, citopatskimi učinki, ki so lahko specifične narave, pojavom vključkov, z določanjem virusnih antigenov v celici in v tekočini kulture; ugotavljanje bioloških lastnosti virusnih potomcev v kulturni tekočini in titriranje virusov v tkivni kulturi, piščančjih zarodkih ali občutljivih živalih; z identifikacijo posameznih virusnih nukleinskih kislin v celicah z molekularno hibridizacijo ali akumulacijami nukleinskih kislin s citokemično metodo s fluorescentno mikroskopijo.

Za izolacijo virusov se uporabljajo dovzetne laboratorijske živali in piščančji zarodki, najpogosteje pa se uporablja tkivna kultura. Prisotnost virusa se običajno določi s specifično celično degeneracijo (citopatski učinek), tvorbo simplastov in sincitijev, detekcijo znotrajceličnih vključkov, pa tudi s specifičnim antigenom, odkritim z imunofluorescenco, hemadsorpcijo, hemaglutinacijo (za hemaglutinirajoče viruse) itd. . Te znake je mogoče odkriti šele po 2-3 prehodih virusa.

Pri delu z virusi se določi njihov titer. Titracijo virusov običajno izvajamo v tkivni kulturi, pri čemer določimo največjo razredčino tekočine, ki vsebuje virus, pri kateri nastanejo tkiva in nastanejo za virus specifična. Metodo s plaki lahko uporabimo za titriranje številnih virusov. Plaki ali negativne kolonije virusov so žarišča celic, ki jih virus uniči v enoslojni tkivni kulturi pod agarsko prevleko. Štetje kolonij omogoča kvantificiranje nalezljive aktivnosti virusov na podlagi tega, da en delec nalezljivega virusa tvori eno ploščo. Plake odkrijemo z barvanjem kulture z intravitalnimi barvili, običajno nevtralno rdečimi; plaki ne absorbirajo barvila in so zato vidni kot svetle lise na ozadju obarvanih živih celic. izraženo kot število enot, ki tvorijo plak, v 1 ml.

Laboratorijska diagnostika virusnih okužb vključuje odkrivanje patogena ali njegovih sestavin v kliničnem materialu; virus iz tega materiala; serodiagnoza. Izbira laboratorijske diagnostične metode je v vsakem posameznem primeru odvisna od narave bolezni, obdobja bolezni in zmogljivosti laboratorija. Sodobne virusne okužbe temeljijo na ekspresnih metodah, ki omogočajo pridobitev odgovora nekaj ur po odvzemu kliničnega materiala v zgodnjih fazah bolezni. Sem spadajo elektron in imunski elektron, pa tudi metoda molekularne hibridizacije, odkrivanje protiteles. razred IgM itd.

Elektronska mikroskopija negativno obarvanih virusov omogoča razlikovanje virusov in določanje njihove koncentracije. Uporaba elektronske mikroskopije pri diagnostiki virusnih okužb je omejena na tiste primere, ko je število virusnih delcev v kliničnem materialu precej visoko (10 5 v 1). ml in zgoraj). Pomanjkljivost metode je nezmožnost razlikovanja virusov, ki pripadajo isti taksonomski skupini. To pomanjkljivost odpravimo z uporabo imunske elektronske mikroskopije. Metoda temelji na tvorbi imunskih kompleksov z dodajanjem specifičnega seruma virusnim delcem ob hkratni koncentraciji virusnih delcev, kar omogoča njihovo identifikacijo. Metoda se uporablja tudi za odkrivanje protiteles. Za ekspresne diagnostične namene se izvaja elektronsko mikroskopski pregled tkivnih izvlečkov, blata, tekočine in izločkov iz nazofarinksa. Elektronska mikroskopija se pogosto uporablja za preučevanje morfogeneze virusa, njene zmožnosti se razširijo z uporabo označenih protiteles.

Metoda molekularne hibridizacije, ki temelji na detekciji virusno specifičnih nukleinskih kislin, omogoča detekcijo posameznih kopij genov in ji ni para v občutljivosti. temelji na hibridizaciji komplementarnih verig ali RNA (sond) in nastanku dvoverižnih struktur. Najcenejša sonda je klonirana rekombinantna DNK. označeni z radioaktivnimi prekurzorji (običajno radioaktivnim fosforjem). Obetavna je uporaba kolorimetričnih reakcij. Obstaja več možnosti za molekularno hibridizacijo: točkovna hibridizacija, blot hibridizacija, sendvič hibridizacija, in situ itd.

Protitelesa razreda IgM se pojavijo prej kot razreda G (3.-5. dan bolezni) in izginejo po nekaj tednih, zato njihovo odkrivanje kaže na nedavno okužbo. Protitelesa razreda lgM odkrijemo z imunofluorescenco ali z encimskim imunotestom z uporabo anti-μ antiserumov (serumi proti težkim verigam lgM).

Za identifikacijo posameznih antigenov virusov in protiteles proti njim v kompleksnih mešanicah brez predhodnega čiščenja beljakovin se uporablja imunobloting. Metoda združuje frakcioniranje proteinov z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu in kasnejšo imunoindikacijo proteinov z metodo encimskega imunskega testa. Ločevanje proteinov zmanjša zahteve po kemijski čistosti antigena in omogoča identifikacijo posameznih parov protiteles. Ta naloga je pomembna na primer pri serodiagnostiki okužbe s HIV, kjer so lažno pozitivne reakcije encimskega imunskega testa posledica prisotnosti protiteles proti celičnim antigenom, ki so prisotna zaradi nezadostnega čiščenja virusnih proteinov. protitelesa v serumu bolnikov proti notranjim in zunanjim virusnim antigenom omogoča določitev stopnje bolezni in pri analizi populacij - virusne beljakovine. Imunobloting za okužbo s HIV se uporablja kot potrditveni test za identifikacijo posameznih virusnih antigenov in protiteles proti njim. Pri analizi populacij se metoda uporablja za ugotavljanje variabilnosti virusnih proteinov. Velika vrednost metode je v možnosti analize antigenov, sintetiziranih s tehnologijo rekombinantne DNK, ugotavljanju njihove velikosti in prisotnosti antigenskih determinant.

Bibliografija: Bukrinskaja A.G. , M., 1986; Virologija, metode, ur. B. Meikhi, . iz angleščine, M., 1988; Priročnik mikrobioloških in viroloških raziskovalnih metod, ed. M.O. Birgera, M., 1982.

1. Mala medicinska enciklopedija. - M.: Medicinska enciklopedija. 1991-96 2. Prvič zdravstvena oskrba. - M.: Velika ruska enciklopedija. 1994 3. Enciklopedični slovar medicinskih izrazov. - M.: Sovjetska enciklopedija. - 1982-1984.

Oglejte si, kaj so "virološke raziskovalne metode" v drugih slovarjih:

Cilj je detekcija virusov, njihova identifikacija (identifikacija) in proučevanje bioloških lastnosti. Za izolacijo virusov (glej Virusi) pri ljudeh, živalih in rastlinah se preučevani material vnese v telo tistih, ki so dovzetni za viruse... ... Velika sovjetska enciklopedija

VIRULOŠKE ŠTUDIJE- virološke študije, niz raziskovalnih metod, ki omogočajo prepoznavanje etiologije virusne bolezni in preučevanje njenih glavnih stopenj V. in. so izolacija virusa iz bolnih in poginulih živali (nabiranje, konzerviranje... Veterinarski enciklopedični slovar

LABORATORIJSKE RAZISKAVE- LABORATORIJSKE RAZISKAVE. glej LABORATORIJSKE ŠTUDIJE. Najpomembnejši pogoj za pridobitev zanesljivih rezultatov raziskav je prava izbira predmetov analize, njihovo pravočasno izbiro in oblikovanje raziskovalnega problema. Pravila vzorčenja ... Ribje bolezni: vodnik

Zdravstveni zavodi oz strukturne delitve terapevtski, preventivni ali sanitarni preventivne ustanove, namenjen izvajanju različnih medicinske raziskave. Ta skupina ne vključuje znanstvenih ... ... Medicinska enciklopedija

I Epidemiologija (epidemija + grški logos nauk) veda, ki proučuje vzorce epidemični proces in razvoj ukrepov za boj proti nalezljivim boleznim ljudi. Zgodovinsko se je Evrazija razvila kot znanstvena disciplina, katerega predmet preučevanja ... ... Medicinska enciklopedija

I Virologija (virus [s] (Virusi) + grški logos doktrina) medicinska biološka veda, ki proučuje viruse. Nastala je konec 19. stoletja, ko je ruski znanstvenik D.I. Ivanovski (1892) je prvi ugotovil obstoj drobnih mikroorganizmov, ki povzročajo... ... Medicinska enciklopedija

- (sinonimi: klopni encefalomielitis, spomladansko-poletni encefalitis, pomladno-poletni meningoencefalitis, tajga encefalitis, ruski daljnovzhodni encefalitis) nalezljiva bolezen, za katero je značilna vročina, zastrupitev in prevladujoča poškodba ... ... Medicinska enciklopedija

domov » Varnost otrok v prometu » Principi in metode viroloških raziskav. Določitev indikacij za bakteriološke, virološke, serološke študije pri dešifriranju etiologije raka in vrednotenju rezultatov