Metode vnosa rekombinantne DNA v bakterijske celice. Nova metoda bistveno izboljša dostavo DNK v celice

Metode neposrednega vnosa genov v celice

Neposredni vnos gena v celico poteka na več načinov:

Transfekcija

Mikroinjekcija

Elektroporacija

Metoda mini celic

Pakiranje v liposomih

Elektronska pištola

pri transfekcija DNK se adsorbira na kristale kalcijevega fosfata (Graham Van der Eb, 1973). Nastanejo delci kalcijeve oborine. Celica jih prevzame s fagocitozo.

Za povečanje učinkovitosti transformacije se specifični DNK, ki vsebuje gen, za katerega se bo izbirala, doda nespecifični nosilec DNK. Običajno se v ta namen DNK vzame iz telečjega timusa ali sperme lososa. Del DNK se veže na membrano in ne vstopi v celice. DNK sprejme od 15 do 90 % celic. Nekaj dni po dajanju je majhen delež celic sposoben izražati tuje gene, nato pa stopnja izražanja upade in 10 -3 - 10 -5 celic je podvrženih bolj ali manj stabilni transformaciji.

Za transfekcijo se uporablja tudi DEAE-dekstran, polimer, ki adsorbira DNA. Učinek vstopa v celico in čas izražanja sta visoka, vendar je pogostost stabilne transformacije manjša kot pri uporabi kalcijeve oborine. Pogostost transfekcije se poveča z glicerolnim šokom (4 minute v 15 % raztopini glicerola v pufru HEPES).

Vsak gen lahko vnesemo v celice, če ga predhodno povežemo s kloniranim selektivnim markerjem. Vendar pa so nadaljnje študije pokazale, da povezovanje zunaj celice ni potrebno. Celice, ki absorbirajo selektivni gen, absorbirajo tudi drugo DNK, ki je prisotna v kalcijevi oborini. Tako z uporabo metode kotransformacije, se lahko skoraj vsak kloniran segment DNK vnese v kultivirane evkariontske celice, če je ta DNK vključena skupaj z izbirnim markerjem v mešanico, da se tvori kalcijeva oborina.

Za transfekcijo se lahko uporabijo kromosomi ali fragmenti kromosomov. Donorske celice so blokirane v fazi mitoze. Mitotični kromosomi se sprostijo pod vplivom osmotskega šoka in homogenizacije. Očistijo se z diferencialnim centrifugiranjem. Kromosomi se nanesejo na površino celic s kalcijevim kloridom in po nekaj urah obdelajo z reagentom, ki lahko predre membrane (na primer glicerol).

Za obdelavo prejemnih celic uporabljamo grobo prečiščene kromosomske pripravke, saj se kromosomi najmanj uničijo. Število kromosomov za obdelavo 1 celice je omejeno. Bolje je uporabiti največ 20 kromosomov na 1 prejemno celico, saj pri visokih koncentracijah kromosomov v suspenziji pride do aglutinacije. Prejemna celica vsebuje fragmente donorskih kromosomov, ki jih je mogoče integrirati v genom in se lahko samostojno razmnožujejo. V vnesenih fragmentih pogosto opazimo delecije.

Vse celice niso sposobne transformirati genomske DNA z visoka frekvenca. Človeški fibroblasti učinkovito vključujejo plazmidno DNA in komajda vključujejo genomsko DNA.

Mikroinjekcija DNK v celice sesalcev je postalo mogoče s pojavom naprave za izdelavo mikropipet s premerom 0,1-0,5 mikronov in mikromanipulatorja (slika 45). Tako so v TK - celice vbrizgali plazmide, ki so vsebovali fragment virusa herpesa z genom za timidin kinazo (TK) in plazmid pBR322 in pokazali, da je TK - gen prodrl v jedra in se v njih normalno razmnoževal. Metodo vnosa DNK z uporabo mikroinjekcije sta v zgodnjih 70. letih razvila Anderson in Diakoumacos. Načeloma lahko z dobro opremo v 1 uri vbrizgamo 500-1000 celic, v najboljših poskusih pa opazimo stabilno integracijo in izražanje vbrizganih genov v 50% celic. Prednost opisane metode je tudi v tem, da omogoča vnos katere koli DNK v poljubne celice in ni potreben selektivni pritisk za vzdrževanje vnesenega gena v celicah.

riž. 45. Vnos DNA z mikroinjiciranjem

Elektroporacija temelji na dejstvu, da visokonapetostni impulzi reverzibilno povečajo prepustnost biomembran. Celice in fragmente DNA, ki jih je treba vnesti v celice, dodamo v medij za elektroporacijo (slika 46). Visokonapetostni impulzi (napetost 200 - 350 V, trajanje impulza 54 ms) prehajajo skozi medij, kar povzroči nastanek por (električni razpad) v citoplazemski membrani, katerih življenjska doba in velikost zadostujeta za makromolekule, kot je DNA. vstopiti v celico iz zunanjega okolja kot posledica osmotskih sil. Hkrati se poveča volumen celice.

Moč električnega polja in trajanje njegovega delovanja, koncentracija transformirajoče DNK in prejemne celice za vsak celični sistem so izbrani eksperimentalno, da bi dosegli visok odstotek absorpcije DNK s preživelimi celicami. Dokazano je, da lahko pod optimalnimi pogoji elektroporacije število transformantov doseže 80 % preživelih celic.

Elektroporacija je bolj fizikalna kot biokemična metoda in zdi se, da se zato pogosto uporablja. Številne študije so pokazale, da lahko elektroporacijo uspešno uporabimo za uvajanje molekul DNA v različne tipe celic, kot so kultivirane živalske celice, praživali, kvasovke, bakterije in rastlinski protoplasti. Zdi se, da je elektroporacijski učinek visokonapetostne razelektritve na dvoslojno lipidno membrano odvisen od njenega polmera ukrivljenosti. Zato majhne bakterijske celice učinkovito absorbirajo DNK pri veliko večji poljski jakosti (10 kV/cm ali več) kot velike živalske in rastlinske celice, ki učinkovito absorbirajo DNK pri poljski jakosti 1-2 kV/cm.

Elektroporacija je najenostavnejša, najučinkovitejša in ponovljiva metoda vnosa molekul DNA v celice. Vendar se je ta metoda do nedavnega uporabljala v omejenem številu laboratorijev zaradi pomanjkanja serijskih naprav – elektroporatorjev. Pojav in izboljšave takšnih naprav v prihodnjih letih bodo vodile k široki uporabi tega pristopa v genskem inženiringu najrazličnejših vrst celic.

riž. 46. Metoda elektroporacije

"Mini celice" pridobljen z blokiranjem donorskih celic v mitozi s kolcemidom. Pri dolgotrajni obdelavi celic s kolcemidom se okoli vsakega kromosoma oblikuje nova jedrska membrana. Obdelava s citohalazinom B in centrifugiranje povzroči nastanek mini celic, ki predstavljajo mikronukleuse, inkapsulirane v citoplazmatski membrani.

Nastale mini celice so zelo občutljive na različne vrste vplivov, zato so za fuzijo izbrani posebni blagi pogoji. Metoda je težka, kapricična, nizka učinkovitost - 10 -6 - 10 -7.

Pakiranje v liposomih uporablja se za zaščito eksogenega genskega materiala pred uničujočim delovanjem restrikcijskih encimov.

Liposomi so sferične lupine, sestavljene iz fosfolipidov. Dobimo jih z močnim stresanjem mešanice vodna raztopina in lipidov ali z ultrazvočno obdelavo vodnih emulzij fosfolipidov. Za vnos DNK v živalske in rastlinske celice so najprimernejši liposomi, sestavljeni iz fosfatidilserina in holesterola. Sistemi prenosa liposomov so nizko toksični za celice.

Metoda biološke balistike (biolistika) je danes ena najučinkovitejših metod za preoblikovanje rastlin, zlasti enokaličnic.

Bistvo metode je, da vektorsko DNK, ki vsebuje genski konstrukt, potreben za transformacijo, napršimo na drobne delce volframa s premerom 0,6-1,2 mikrona. Delci volframa, ki nosijo DNK, se nanesejo na celofanski substrat in postavijo v biolistično pištolo. Kalus ali celično suspenzijo nanesemo na petrijevko z agarskim medijem in jo postavimo pod biolistično pištolo na razdalji 10-15 cm, s pomočjo vakuumske črpalke pa znižamo tlak v pištoli na 0,1 atm. V trenutku, ko se pritisk sprosti, se volframovi delci z ogromno hitrostjo izstrelijo iz biolistične pištole in raztrgajo celične stene, vstopijo v citoplazmo in jedro celice.

Značilno je, da celice, ki se nahajajo neposredno v središču, umrejo zaradi ogromnega števila in pritiska volframovih delcev, medtem ko se najbolj uspešno transformirane celice nahajajo v območju 0,6-1 cm od središča. Nato celice previdno prenesemo v medij za nadaljnjo kultivacijo in regeneracijo.

Z uporabo biolistične pištole so preoblikovali enokaličnice, kot so koruza, riž, pšenica in ječmen. V tem primeru smo dobili stabilne transformirane rastline. Poleg uspeha pri pridobivanju transgenih enokaličnic se biolistična transformacija uporablja za neposreden prenos DNA v embriogen cvetni prah in kasnejšo hitro proizvodnjo transgenih dihaploidnih rastlin, ki so pomemben korak pri žlahtnjenju. Trenutno se s to metodo izvaja transformacija rastlin tobaka in po regeneraciji haploidnih rastlin so pridobljeni stabilni transformanti.

8860 0

Trenutno jih je znanih okoli 40 na različne načine dostava rekombinantne DNA v celice na različne načine reševanje problema prehajanje plazemske membrane. Enotne klasifikacije metod za dostavo rekombinantne DNK v celice še ni. Vsak avtor recenzije razvršča po svoje, morda zato, ker za mnoge empirično ugotovljene metode mehanizem premagovanja membrane še vedno ni jasen, na primer za transformacijo. Negotovost je tudi glede terminologije, kar v hitro razvijajočem se okolju ni presenetljivo novo območje znanost in praksa.

Vsaka metoda vnosa tuje DNK v celice ima svoje značilnosti, prednosti in slabosti glede celičnega preživetja, učinkovitosti dajanja, vsestranskosti in možnosti tehnične izvedbe. Izbira metode je odvisna od vrste gostiteljskih celic in vrste uporabljenega vektorja ter od osebnih preferenc in zmožnosti eksperimentatorja. Nekaj najbolj znanih metod dostave DNK v ciljne celice je podrobno obravnavanih spodaj.

Preobrazba sama po sebi splošni pomen je proces vnosa proste DNK v celico. V ožjem pomenu se izraz uporablja predvsem za bakterije, ki označujejo proces privzema rekombinantne DNA s strani kompetentnih celic, ki ga povzroči temperaturni fazni prehod celične membrane. E. coli je najpogostejši organizem pri delu z rekombinantno DNK in da se zagotovi vnos plazmidne DNK v celice, se celice inkubirajo z ledeno mrzlo raztopino CaCl2 in DNK, nato pa se izpostavijo toplotni šok pri 42 °C ~1 min.

Očitno se zaradi takšnega zdravljenja pojavi lokalno uničenje celične stene. Učinkovitost transformacije, ki je definirana kot število transformantov na 1 μg dodane DNA,
v tem primeru je to približno 10.000 - 10.000.000. Učinkovitost te metode je nizka, transformira se približno manj kot 0,1 % celic, vendar se ta pomanjkljivost kompenzira z uporabo selekcijskih shem, ki omogočajo hitro identifikacijo želenih klonov.

Celice, ki lahko absorbirajo tujo DNK, imenujemo kompetentne. Delež teh celic v populaciji je običajno zelo majhen, vendar ga je mogoče povečati s posebnim hranilni medij, pogoji gojenja in kemični induktorji sposobnosti (izbrani praviloma empirično). Pogosto uporabljena stopnja pri pripravi kompetentnih celic je proizvodnja sferoplastov – celic, ki delno ali v celoti (protoplasti) nimajo zunanje toge celične stene.

To je na primer edini način za učinkovito transformacijo številnih gram-pozitivnih bakterij iz rodov Bacillus, Listeria, Streptomyces itd. Nekatere metode transformacije kvasovk vključujejo tudi stopnje encimske odstranitve celične stene kvasovk z uporabo glukozidaz. Za organizme, ki so odporni na kemične induktorje sposobnosti ali nimajo naravne sposobnosti, se uporabljajo drugi sistemi za dostavo DNK.

Konjugacija. Obstajajo bakterijski plazmidi (konjugativni plazmidi), ki imajo sposobnost ustvarjanja medceličnih stikov, preko katerih prehajajo iz ene celice v drugo. Nastanek stikov med donorskimi in prejemnimi celicami zagotavljajo konjugativne lastnosti plazmidov, sam prenos DNK pa zagotavljajo mobilizacijske lastnosti. V tem primeru lahko konjugativni plazmid nosi s seboj navaden plazmidni vektor, ki se nahaja v isti celici.

Na ta način je mogoče transformirati prejemne celice, ki jih je težko transformirati na druge načine. Prikazan je bil na primer mobilizacijski prenos shuttle vektorja pAT187 s širokim spektrom gostiteljev iz E. coli v različne gram-pozitivne bakterije (rod Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus itd.), čeprav z veliko manjšo učinkovitostjo kot pri prenosu med različnih sevov E. coli.

Poleg tega je bila pred kratkim dokazana možnost konjugativnega prenosa DNK iz bakterijskih celic v gojene živalske celice. Med postopkom konjugacije se prenese le ena veriga donorskega plazmida, na kateri se nato sintetizira druga veriga. Posledica tega je, da konjugirano prenesenega plazmida ne napadejo restrikcijski encimi gostitelja. Učinkovitost te metode za bakterije je primerljiva s transformacijo.

Virusna infekcija. Za vnos vektorjev na osnovi virusov se pogosto uporablja naravna kužna pot okužbe gostiteljske celice, ki je odvisna od vrste virusa.

Metode perforacije. Ena od priljubljenih metod za vnos nukleinskih kislin v ciljne celice je elektroporacija - začasno ustvarjanje por v dvoslojni lipidni membrani pod kratkotrajno izpostavljenostjo električnemu polju. Je univerzalna fizikalna metoda transformacije, katere tehnika je razvita za skoraj vse vrste celic.

Pri delu z E. coli med elektrode postavimo pripravljeno celično suspenzijo (~50 μl) in DNA ter sprožimo en tokovni impulz v trajanju ~4,5 ms pri napetosti 1,8 kV, razdalja med elektrodama je 1 mm. Po takšni obdelavi se učinkovitost transformacije poveča na 109-1011 za majhne plazmide (~3-6 kb) in na 106 za velike (~135 kb). Podobni pogoji se uporabljajo za vnos vektorja BAC v E. coli.

Zdi se, da je elektroporacijski učinek visokonapetostne razelektritve na dvoslojno lipidno membrano odvisen od njenega polmera ukrivljenosti. Zato majhne bakterijske celice učinkovito absorbirajo DNK pri veliko večji poljski jakosti (12-18 kV/cm) kot velike živalske in rastlinske celice, ki učinkovito absorbirajo DNK pri poljski jakosti 1-2 kV/cm. Elektroporacija je najenostavnejša, najučinkovitejša in ponovljiva metoda vnosa molekul DNA v celice, ki pa zahteva posebno napravo elektroporator.

Druge perforacijske metode za dostavo DNK v celice: ultrazvočna obdelava celic, strganje celic s substrata v prisotnosti eksogenega materiala, centrifugiranje celic v mediju z DNK v kombinaciji z elektroporacijo, osmotsko perforiranje plazemske membrane, razgradnja celic z laserjem. mikrožarka, uporaba toksina streptolizin-O, ki tvori pore.

Transfekcija. Sprva je ta izraz pomenil vnos virusne DNK v celice, zdaj pa se je njegov pomen razširil na vnos kakršne koli tuje DNK v evkariontske celice. Izraz »transformacija«, ki se nanaša na proces vnosa DNK v celico za prokarionte in kvasovke, se je izkazal za neprijetnega za uporabo, saj je v zvezi z živalskimi celicami transformacija transformacija normalnih celic v rakave. V ožjem smislu se transfekcija nanaša predvsem na vnos DNK v evkariontske celice z uporabo različnih kemičnih reagentov.

Ena prvih razvitih metod za učinkovito transfekcijo je bila inkubacija DNA z DEAE-dekstranom. Nastala učinkovitost je bila primerljiva z bakterijsko transformacijo in je dosegla 106 transfektantov na µg DNA.

Mehanizem delovanja DEAE-dekstrana ni povsem ugotovljen, vendar je znano, da se veže na DNA in celično membrano ter spodbuja pinocitozo (slika 2.8), čeprav ga celice ne prevzamejo. Slabosti metode vključujejo toksičnost DEAE-dekstrana za nekatere vrste celic, odvisnost učinkovitosti od kakovosti zdravila in zelo nizko pogostost pridobivanja stabilnih transfektantov.

riž. 2.8. Shema vnosa DNA kot dela različnih kompleksov v celico z endocitozo: fagocitoza in pinocitoza (a). Shematski prikaz delca nelipidnega polikationa v dendroformi z vezano DNA, katerega negativni naboj kompenzira kationski polimer (b)

Učinkovitost transfekcije se je povečala za 10-100-krat z inkubacijo celic z DNA, oborjeno s kalcijevim fosfatom. Goste delce oborine kalcijeve DNA celica absorbira s fagocitozo (slika 2.8), vendar le majhen del prodrlih molekul doseže jedro in se integrira v kromosomsko DNA. Metoda s kalcijevim fosfatom je učinkovitejša in cenejša, vendar povzroča lomljenje molekul DNK, kar pretvori krožne molekule v linearno obliko, včasih neinfektivno v primeru virusne transfekcije. Poleg tega je treba pogoje za transfekcijo s kalcijevim fosfatom izbrati posebej za vsako ciljno celico.

Med iskanjem drugih transfekcijskih reagentov je bilo ugotovljeno, da lahko polimerne molekule s presežnim kationskim nabojem znatno povečajo učinkovitost transfekcije. Polimerni kationi tvorijo stabilne komplekse z nevtraliziranimi naboji z nukleinskimi kislinami, ki lahko z visoko učinkovitostjo prenašajo DNK in RNK v celico in ju zaščitijo pred delovanjem endonukleaz na poti do jedra (slika 2.9).

riž. 2. 9. Shema transporta DNA v celično jedro kot del kompleksa polikation-DNA, vezanega na specifičen ligand z endocitozo, posredovano z ligandom

Sintetični nelipidni polimerni kationi v linearni ali razvejeni konformaciji (dendritična oblika) lahko kondenzirajo DNA in RNA v relativno majhne delce, ki se nato vežejo na celično membrano in vstopijo v celico z nespecifično endocitozo. Trenutno se za transfekcijo iz skupine nelipidnih polikacij uporabljajo predvsem polietilenimini, poliamidoamini in dendrimeri na njihovi osnovi, kationski proteini, kot so polilizin, protamin in histoni, pa tudi različni komercialni izdelki, kot je PAMAM.

Revolucija je bila uvedba v prakso prvega nizkotoksičnega kationskega lipida DOTMA (1,2-dioleil-3-N,N,N-trimetilaminopropana), ki so ga sintetizirali Feigner (1987) et al. Učinkovitost transfekcije z uporabo kationskega lipida (slika 2.10) je bila približno 100-krat večja kot pri katerem koli drugem kemičnem reagentu, z visokim deležem stabilnih transgenih celic.

riž. 2. 10. Struktura kompleksa z DNA (a) in splošna zgradba kationskega lipidnega polimera (b). Kationski lipidni polimeri (linearni in razvejani), podobni po strukturi in lastnostih fosfolipidom celične membrane, s preprostim mešanjem reagentov tvorijo komplekse z DNA v obliki večplastnih kationskih liposomov (a). Takšni kompleksi vstopajo v celico z endocitozo ali fuzijo s celično membrano skozi lipidni del

Hkrati je bil v prakso uveden nov izraz "lipofekcija", ki poudarja visoko učinkovitost genetske transformacije celic, kar približuje lipidno-kationske komplekse infektivnim virusnim delcem.

Na podlagi tega uspeha so bile razvite številne različice teh spojin (lipofektin, lipofektamin, cellfectin itd.).

Vzporedno so bili razviti dostavni nosilci na osnovi fosfolipidnih liposomov, napolnjenih z DNA ali RNA.

Majhne kroglice umetnih membran se lahko zlijejo s plazemskimi membranami celic ali jih prevzame endocitoza, pri čemer se vsebina sprosti v celico. Nizko učinkovitost transfekcije liposomov smo povečali z vnosom fosfolipidov v strukturo liposomov, na primer kardiolipina in fosfatidiletanolamina, ki skupaj z dvoslojnimi membranami tvorita tudi obrnjene micelarne strukture, znane kot kubične in heksagonalne faze, ki so sposobne iniciirati membrano. fuzija.

Liposomska metoda je precej muhasta in zahteva skrbno izbiro vseh pogojev za učinkovito transfekcijo specifičnih celic. Poleg tega postopek inkapsulacije, običajno sonikacija, pogosto poškoduje velike molekule DNA.

Novo stopnjo v razvoju transfekcijskih reagentov je bil razvoj učinkovitejšega in ciljanega dovajanja nukleinskih kislin v specifične tarčne celice z vnosom različnih ligandov v strukturo sintetičnih transfekcijskih reagentov in liposomov za vezavo na membranske receptorske proteine. Prisotnost takšnih ciljnih skupin (ligandov), ki jih prepoznajo celični receptorji, omogoča uporabo mehanizmov endocitoze, ki jih posredujejo ligandi (glej sliko 2.9).

Kot taki ligandi se uporabljajo proteini in peptidi, ki jih prepoznajo receptorji; oligosaharidi, saj so na površini mnogih živalskih celic lektini - receptorski proteini, ki jih specifično vežejo; polisaharidi. Procesi interakcije s celicami takšnih ciljnih kompleksov reagentov za transfekcijo DNA (RNA) so podobni prodiranju virusnih delcev v celico.

Trenutno biotehnološka podjetja ponujajo široko paleto različnih transfekcijskih reagentov - od najpreprostejših in najcenejših do najnovejših dosežkov, specializiranih za različne tipe celic in naloge. Intenzivno poteka tudi ustvarjanje novih, še učinkovitejših transfekcijskih reagentov.

Mikroinjekcija - z mikroiglo prebodemo celično membrano in raztopino, ki vsebuje DNK, vbrizgamo v citoplazmo celice ali neposredno v jedro, če je jedro dovolj veliko (npr. jedro jajčeca). Mikroinjektiranje DNA v celice sesalcev je postalo možno s prihodom naprave za izdelavo mikropipet s premerom 0,1-0,5 μm in mikromanipulatorja. Metoda je zelo učinkovita; delež celic s stabilno integracijo in izražanjem vbrizganih genov lahko doseže 50 %. Prednost opisane metode je tudi v tem, da omogoča vnos katere koli DNK v poljubne celice in ni potreben selektivni pritisk za vzdrževanje vnesenega gena v celicah.

Balistična transfekcija, biobalistika ali biolistika (obstreljevanje z mikrodelci), temelji na obstreljevanju celic z mikrosferami, velikimi približno 1-2 mikrona, prevlečenimi z DNA. Uporabljajo se mikrodelci zlata, volframa (včasih fitotoksični), silikona in različne sintetične nanosfere. Mikrodelci, prevlečeni z DNK, prehajajo skozi celične plasti in prenašajo genetski konstrukt neposredno v organele in celična jedra. V ta namen ustvarjena »genska pištola«, ki jo je leta 1987 razvil J. Sanford za vnos DNK v žitna zrna, je po zasnovi podobna zračnim puškam (slika 2.11).

riž. 2.11. Vnos rekombinantne DNA v rastlinske liste z uporabo "genske pištole" za večkratno uporabo podjetja Bio-Rad (a) in njene splošne sheme (b). Impulz helija izvrže mikrodelce, prevlečene z DNA ali RNA, iz kapsule vzorca. Mikrodelci, ki nosijo DNK, se pospešijo in fokusirajo za maksimalen prodor v celice, premikajo se vzdolž pospeševalnega kanala in vzdolž cevi pištole, medtem ko se na širokem izhodu tok helija difuzno razliva vstran. Distančni filter ohranja optimalno razdaljo zadetka tarče, hkrati pa maksimira odstranitev helija, da zmanjša škodljive učinke na celične površine.

Globina prodiranja mikrodelcev je običajno majhna - do 1 mm, vendar kdaj posebni pogoji luščenje lahko mikrodelci prodrejo v tkivo do globine 4-5 mm in prenesejo gene, na primer v vlakna progastih mišic. Balistična transfekcija je zelo učinkovita tudi tam, kjer so debele celične stene (kvasovke, rastline) ovira za številne druge metode dostave in se uporablja vključno s tkivi, organi in celo celimi organizmi. Trenutno se pogosto uporablja v genski terapiji za proizvodnjo transgenih živali in rastlin.

Ta raznolikost transfekcijskih orodij in metod je posledica različnih nalog, širokega nabora uporabljenih ciljnih celic in vrst nukleinskih kislin, dostavljenih celicam, pa tudi potreb družbe po pridobivanju vse bolj učinkovitih sredstev za dostavo genetskih informacij celicam, tkivom in celotne organizme. Posebna pozornost je namenjena razvoju transfekcijskih reagentov in metod v povezavi z osupljivimi možnostmi človeške genske terapije, ki zahteva ciljno usmerjena, zelo učinkovita in varna sredstva za dostavo genov.

Stabilen in prehoden vnos tuje DNK v celico. Po vnosu rekombinantne DNK v evkariontsko celico le ta majhen del konča v jedru, saj je jedrska membrana težka ovira za tujo DNK. V jedru se lahko rekombinantna DNA integrira v kromosom ali obstaja nekaj časa v zunajkromosomskem stanju.

V skladu s tem ločimo stabilno transfekcijo, ko se rekombinantna DNA integrira v kromosome prejemnih celic in postane njihov sestavni del, ter začasno ali prehodno transfekcijo, pri kateri obstajajo molekule rekombinantne DNA in se prepisujejo v jedra v zunajkromosomsko stanje za kratek čas. Stabilno dedovanje vnesene tuje DNK je glavni pogoj za pridobitev transgenih organizmov v gospodarske namene.

Zato je podan razvoj metod za vnos DNA v celice, ki vodijo k pridobivanju večjega deleža stabilnih transformantov. Posebna pozornost. Poleg tega velik odstotek stabilnih transformantov omogoča tudi opuščanje selektivnih in markerskih genov, ki so balast pri ustvarjanju transgenih organizmov.

NA. Voinov, T.G. Volova

Rekombinantna DNK se vnese v prejemne celice. V genskem inženiringu imajo take prejemne celice dve vlogi. 1. Omogočajo iskanje klonov sintetizirane rekombinantne DNK v genski banki. 2 Pozneje se takšne prejemne celice lahko uporabijo za pridobivanje ciljnih produktov.

Način vnosa rekombinantne DNA se upošteva glede na vrsto vektorja, s katerim je bila pridobljena rekombinantna DNA in v celice katerih organizmov jo je treba vnesti s transformacijo celice ali protoplasta ali z metodo elektroporacije. Če rekombinantno DNA pridobimo iz fagov, jo lahko vnesemo v izolirano DNA – to je transvekcija. Lahko vnesete nedotaknjene delce faga - to je okužba (kozmidi, fazmidi).

dr. metode genetske izmenjave - konjugacija, transdukcija.

V rastlinskih celicah – transformacija rastlinskih protoplastov, obdelava rastlinskih celic ali tkiv z rekombinantno DNA; pogosto se uporablja vbrizgavanje rekombinantne DNA v jedro; uporaba liposomov. Liposomi so sferične strukture, ki imajo lipidno lupino, znotraj katere je rekombinantna DNA. Za vnos v živalske celice - virusne okužbe, metoda elektroporacije, mikroinjekcija v jedro. Če po vnosu rekombinantne DNK vse celice v telesu podedujejo, potem govorijo o pridobitvi transgenega organizma.

Elektroporacija - celice ali protoplasti so za kratek čas izpostavljeni visokonapetostnemu toku (2000-4000 voltov). Posledično nastanejo pore v celični membrani velikosti cca. 30 nm, ki lahko obstaja 1-2 minuti in skozi katerega lahko rekombinantna DNA vstopi v celico. Pore se nato zaprejo in DNK ostane v celici. To je univerzalna metoda.

Balistična metoda– uporabljajo se predvsem pri evkariontih. Uporabljajo se balistične puške, v katere se vnesejo delci AK ali W, na katere se razprši rekombinantna DNA. Nato se s pomočjo inertnih plinov pri P takšni delci iz pištole izstrelijo v celično kulturo. Po različnih vzorcih pride del delcev v jedro in rekombinantna DNK se tam zadrži.

Iskanje klonov z rekombinantno DNK.

Ta stopnja je težka in nepredvidljiva.

Najenostavnejša metoda je iskanje klonov po fenotipu po vnosu rekombinantne DNK(npr. pigmentacija). Lahko uporabite komplementacijske teste, vendar je treba imeti mutirane celice, ki imajo napako v sintezi aktivnega produkta.

Hibridizacijske metode zahtevajo prisotnost specifičnih označenih DNA ali RNA sond. Pogosteje so označeni s P 32. Sonde m.b. kratke oligonukleotidne sekvence, ki ustrezajo najbolj ohranjenemu delu iskanega gena. Ta ohranjena zaporedja lahko vključujejo do 100 nukleotidov za prokarionte in do 1000 za evkarionte.

Po vnosu rekombinantne DNA kolonije, nastale na gojišču, prenesemo v poseben nitrocelulozni filter. Podvrženi so lizi in kasnejši denaturaciji DNA z alkalijo. DNK se tesno veže na filter. Filter speremo in obdelamo z radioaktivno označeno sondo ter določimo klon, na katerega se je ta sonda vezala.

Imunokemijske metode - po vnosu rekombinantne DNA klone liziramo in obdelamo s protitelesi proti ustreznemu produktu. Takšna protitelesa so označena.

Uvod

1 Glavne skupine gensko spremenjenih encimov

1.1 Restrikcijski encimi

1.1.1 Mehanizem delovanja restrikcijskih encimov

1.1.2 Izdelava omejitvenih kart

1.3 Ligaze

2 Vnos novega gena v celico

2.1 Regulacija izražanja genov pri prokariontih

2.2 Metode neposrednega vnosa gena v celico

2.3 Vnos genov v celice sesalcev

2.4 Genetska transformacija somatskih celic sesalcev

2.5 Genska terapija

2.6 Vzreja transgenih živali

Zaključek

Bibliografija

Uvod

Gensko inženirstvo je in vitro gradnja funkcionalno aktivnih genetskih struktur (rekombinantne DNK) ali z drugimi besedami ustvarjanje umetnih genetskih programov (Baev A. A.). Po E. S. Piruzjanu je genetski inženiring sistem eksperimentalnih tehnik, ki omogočajo izdelavo umetnih genetskih struktur v laboratoriju (in vitro) v obliki tako imenovanih rekombinantnih ali hibridnih molekul DNK.

Govorimo o usmerjeni, po vnaprej določenem programu, izgradnji molekularnih genetskih sistemov izven telesa z njihovim kasnejšim vnašanjem v živi organizem. V tem primeru rekombinantna DNA postane sestavni del genetskega aparata prejemnega organizma in mu daje nove edinstvene genetske, biokemične in nato fiziološke lastnosti.

Cilj uporabnega genskega inženiringa je oblikovati takšne rekombinantne molekule DNA, ki bi ob vnosu v genetski aparat dale telesu uporabne lastnosti za človeka.

Tehnologija rekombinantne DNK uporablja naslednje metode:

Specifična cepitev DNA z restrikcijskimi nukleazami, pospeševanje izolacije in manipulacije posameznih genov;

Hitro sekvenciranje vseh nukleotidov v očiščenem fragmentu DNA, ki omogoča določitev meja gena in aminokislinskega zaporedja, ki ga kodira;

Konstrukcija rekombinantne DNA;

Hibridizacija nukleinskih kislin, ki omogoča detekcijo specifičnih zaporedij RNA ali DNA z večjo natančnostjo in občutljivostjo na podlagi njihove sposobnosti vezave komplementarnih zaporedij nukleinskih kislin;

Kloniranje DNA: pomnoževanje in vitro z verižno reakcijo s polimerazo ali vnos fragmenta DNA v bakterijsko celico, ki po takšni transformaciji ta fragment razmnoži v milijonih kopij;

Vnos rekombinantne DNK v celice ali organizme.

Zgodovina genskega inženiringa

Gensko inženirstvo se je pojavilo zaradi dela številnih raziskovalcev v različnih vejah biokemije in molekularne genetike. Dolga leta so beljakovine veljale za glavni razred makromolekul. Obstajala je celo domneva, da so geni beljakovinske narave. Šele leta 1944 so Avery, McLeod in McCarthy dokazali, da je DNK nosilec dednih informacij. Od tega časa se je začelo intenzivno preučevanje nukleinskih kislin. Desetletje kasneje, leta 1953, sta J. Watson in F. Crick ustvarila model dvoverižne DNK. Letošnje leto velja za rojstno leto molekularne biologije.

Na prelomu 50. in 60. let prejšnjega stoletja so bile lastnosti genetske kode pojasnjene, do konca 60. let pa je bila njegova univerzalnost eksperimentalno potrjena. Prišlo je do intenzivnega razvoja molekularne genetike, katere objekti so bili E. coli, njeni virusi in plazmidi. Razvite so bile metode za izolacijo visoko prečiščenih pripravkov intaktnih molekul DNA, plazmidov in virusov. DNA virusov in plazmidov je bila vnesena v celice v biološko aktivni obliki, kar je zagotovilo njeno replikacijo in izražanje ustreznih genov. V 70. letih so odkrili številne encime, ki katalizirajo reakcije pretvorbe DNA. Posebno vlogo pri razvoju metod genskega inženiringa imajo restrikcijski encimi in DNA ligaze.

Zgodovino razvoja genskega inženiringa lahko razdelimo na tri faze. Prva stopnja je povezana z dokazovanjem temeljne možnosti pridobivanja rekombinantnih molekul DNA in vitro. Ta dela se nanašajo na proizvodnjo hibridov med različnimi plazmidi. Možnost ustvarjanja rekombinantnih molekul z uporabo originalnih molekul DNK iz različne vrste in bakterijskih sevov, njihovo sposobnost preživetja, stabilnost in delovanje.

Druga faza je povezana z začetkom dela na pridobivanju rekombinantnih molekul DNA med kromosomskimi geni prokariontov in različnimi plazmidi, kar dokazuje njihovo stabilnost in sposobnost preživetja.

Tretja faza je začetek dela na vključevanju evkariontskih genov, predvsem živali, v vektorske DNK molekule (DNK, ki se uporablja za prenos genov in se lahko vgradi v genetski aparat prejemne celice).

Formalno velja za rojstni datum genskega inženiringa 1972, ko so na Univerzi Stanford P. Berg, S. Cohen, H. Boyer in sodelavci ustvarili prvo rekombinantno DNA, ki je vsebovala fragmente DNA virusa SV40, bakteriofaga in E. coli. .

1 Glavne skupine gensko spremenjenih encimov

Genetski inženiring je potomec molekularne genetike, a se je rodil zaradi uspehov genetske encimologije in kemije nukleinskih kislin, saj so encimi orodje molekularne manipulacije. Čeprav lahko včasih delamo s celicami in celičnimi organeli z uporabo mikromanipulatorjev, tudi najmanjši mikrokirurški instrumenti ne bodo pomagali pri delu z makromolekulami DNA in RNA. Kaj storiti? Encimi delujejo kot "skalpel", "škarje" in "nit za šivanje".

Samo oni lahko najdejo določena nukleotidna zaporedja, tam »izrežejo« molekulo ali, nasprotno, »zakrpajo« luknjo v verigi DNK. Ti encimi že dolgo delujejo v celicah in opravljajo delo na replikaciji (podvojitvi) DNA med celično delitvijo, popravljanju poškodb (obnavljajo celovitost molekule), v procesih branja in prenosa genetske informacije iz celice v celico ali znotraj celice. celica. Naloga genetskega inženirja je izbrati encim, ki bi izpolnjeval zadane naloge, torej bi bil sposoben delati z določenim delom nukleinske kisline.

Vedeti je treba, da encimi, ki se uporabljajo v genskem inženiringu, nimajo vrstne specifičnosti, zato lahko eksperimentator združi fragmente DNK katerega koli izvora v zaporedju po lastni izbiri v eno celoto. To omogoča genskemu inženiringu, da premaga vrstne ovire, ki jih je postavila narava, in izvede medvrstno križanje.

Encime, ki se uporabljajo pri izdelavi rekombinantne DNA, lahko razdelimo v več skupin:

Encimi, ki proizvajajo fragmente DNA (restrikcijski encimi);

Encimi, ki sintetizirajo DNA na predlogi DNA (polimeraze) ali RNA (reverzne transkriptaze);

Encimi, ki povezujejo fragmente DNA (ligaze);

Encimi, ki omogočajo spremembe v strukturi koncev fragmentov DNA.

1.1 Restrikcijski encimi

Splošno sprejeto je, da so izrazi "restrikcijski encim", "restrikcijska endonukleaza" in "lokacijsko specifična endodeoksiribonukleaza" sinonimi.

Vse bakterijske restrikcijske endonukleaze prepoznajo specifična, precej kratka zaporedja DNK in se nanje vežejo. Ta proces spremlja rezanje molekule DNA bodisi na samem prepoznavnem mestu bodisi na drugem mestu, ki je odvisno od vrste encima. Skupaj z restrikcijsko aktivnostjo ima bakterijski sev sposobnost metiliranja DNA; Za ta proces je značilna enaka specifičnost zaporedja DNK kot za restrikcijo. Metilaza doda metilne skupine ostankom adenina ali citozina na istem mestu, kjer se veže restrikcijski encim. Zaradi metilacije mesto postane odporno na restrikcije. Zato metilacija ščiti DNK pred rezanjem.

Obstajajo 3 glavni razredi restrikcijskih encimov: 1, 2 in 3.

Vsi restrikcijski encimi prepoznajo strogo določena zaporedja na dvoverižni DNK, vendar restrikcijski encimi razreda 1 naredijo prekinitve na poljubnih točkah v molekuli DNK, restrikcijski encimi razreda 2 in 3 pa prepoznajo in cepijo DNK na strogo določenih točkah znotraj prepoznavnih mest ali na lokacija na določeni razdalji od njih.

Encimi tipa 1 in 3 imajo zapleteno strukturo podenote in imajo dve vrsti dejavnosti - modificiranje (metiliranje) in ATP-odvisno endonukleazo.

Encimi razreda 2 so sestavljeni iz dveh ločenih proteinov: restrikcijske endonukleaze in modifikacijske metilaze; zato se v genskem inženirstvu uporabljajo samo encimi razreda 2. Potrebujejo magnezijeve ione kot kofaktorje.

Trenutno je izoliranih več kot 500 restrikcijskih encimov razreda 2, vendar so med encimi, izoliranimi iz različnih mikroorganizmov, tudi taki, ki prepoznajo enaka zaporedja na DNK. Takšne pare ali skupine imenujemo izoshizomeri. Razlikujemo med pravo izoshizomerijo, ko encimi prepoznajo isto nukleotidno zaporedje in prekinejo DNK na istih točkah, in lažno, ko encimi, ki prepoznajo isto mesto na DNK, povzročijo prekinitve na različnih točkah znotraj istega mesta.

Večina restrikcijskih encimov razreda 2 prepozna zaporedja, ki vsebujejo od 4 do 6 nukleotidnih parov, zato se restrikcijski encimi delijo na majhne in velike. Majhni restrikcijski encimi prepoznajo tetranukleotide in vnesejo veliko več prelomov v molekule kot veliki restrikcijski encimi, ki prepoznajo zaporedje šestih nukleotidnih parov. To je posledica dejstva, da je verjetnost pojava določenega zaporedja štirih nukleotidov veliko večja kot pri zaporedju šestih nukleotidov. Na primer, DNK bakteriofaga T7, sestavljenega iz 40.000 baznih parov, nima zaporedja, ki bi ga prepoznal restrikcijski encim R1 iz E. coli.

Restrikcijska encima Hpa II in Alu (iz Arthrobacter luteus) sta malo cepljiva, Eco R I (iz Escherichia coli) in Hind III pa sta veliko cepljiva. Če predpostavimo, da so mesta za prepoznavanje restrikcijskih encimov naključno razporejena vzdolž verige DNA, se mora tarča za encime, ki prepoznajo zaporedje (mesto) štirih nukleotidov, pojaviti v povprečju enkrat na 256 baznih parov, za encime, ki prepoznajo šest nukleotidov, pa na vsakih 4096 baz. parov. Če je restrikcijsko mesto znotraj gena, bo zdravljenje z restrikcijskim encimom DNA povzročilo njegovo inaktivacijo. Verjetnost takega dogodka je zelo velika pri zdravljenju z restrikcijskimi encimi majhnega reza in nepomembna pri uporabi endonukleaz velikega reza. Zato se za pridobitev nedotaknjenega gena cepitev izvaja izmenično z več restrikcijskimi encimi velikega reza ali pa se uporablja tehnika "podomejevanja", tj. restrikcija se izvede v pogojih, ko pride do cepitve samo na enem mestu.

1.1.1 Mehanizem delovanja restrikcijskih encimov

Palindromi 4-6 baznih parov - restrikcijska mesta - pogosto delujejo kot tarče (prepoznavna mesta). Prepoznavne točke z restrikcijskimi encimi so simetrične glede na rotacijo za 180 °C, kar pomeni, da je zaporedje nukleotidov od leve proti desni v eni verigi enako kot od desne proti levi v drugi. Simetrija pomeni, da se tisti, ki jih je treba metilirati, nahajajo na obeh verigah DNK. Posledično je lahko tarčno mesto popolnoma metilirano (obe verigi sta modificirani), pol metilirano (samo ena veriga je metilirana) ali nemetilirano.

Popolnoma metilirano mesto ni predmet niti omejitev niti sprememb. Restrikcijski encim ne prepozna hemimetiliranega mesta, vendar ga lahko metilaza pretvori v popolnoma metilirano. Pri bakterijah je metilacija običajno povezana z ohranjanjem obstoječega stanja modifikacije. Replikacija popolnoma metilirane DNA vodi do tvorbe hemimetilirane DNA. Verjetno je prepoznavanje hemimetiliranih mest normalen korak v delovanju metilaze in vivo.

Nemetilirano ciljno mesto zagotavlja substrat bodisi za omejitev bodisi za modifikacijo in vitro. V celici je bolj verjetno, da bo nespremenjena DNK omejena. Reakcija rezanja poteka v dveh stopnjah. Najprej se prereže ena veriga DNK, nato pa se v bližini prereže druga. V regijah, ki mejijo na vsako stran mesta rezanja, lahko pride do eksonukleotske razgradnje. Pride do učinkovite hidrolize ATP, katere vloga še ni pojasnjena.

Kako encim prepozna eno mesto in odreže drugo, precej oddaljeno? Pomembno je omeniti, da se beljakovina nikoli ne loči od molekule DNK, na katero se je prvotno vezala. Če je encim inkubiran z mešanico modificirane in nespremenjene DNA, prednostno reže nespremenjeno DNA. Zato se pri prepoznavanju vezavnega mesta protein ne loči od nemetilirane DNA, da bi našel mesto rezanja.

Obstajata dva alternativna modela, ki pojasnjujeta odnos med prepoznavnimi in rezalnimi mesti: po enem od njiju se premika encim, po drugem pa DNK. Če se encim premika, se bo njegovo gibanje vzdolž DNK nadaljevalo, dokler ne izbere mesta rezanja. Če se DNK premakne, ostane encim pritrjen na mestu prepoznave, DNK pa se potegne skozi drugo vezavno mesto na encimu in to se nadaljuje, dokler encim ne doseže območja rezanja (še ni označeno). Pridobljeni so bili elektronski mikroskopski podatki, ki kažejo, da encim povzroči nastanek zanke v DNK in se zdi, da ostane povezan z mestom prepoznave po rezanju; ti podatki podpirajo drugi model.

1.1.2 Izdelava zemljevidov omejitev

Restrikcijski encimi so postali učinkovito raziskovalno orodje. Omogočajo pretvorbo zelo velikih molekul DNK v niz fragmentov, dolgih od nekaj sto do več tisoč baz. Z elektroforezo v agaroznem gelu (glejte razdelek 1) je mogoče zlahka ločiti fragmente DNK različnih velikosti in nato pregledati vsak fragment posebej.

Kratki fragmenti se selijo veliko hitreje kot dolgi. Pri relativno visoki koncentraciji agaroze veliki fragmenti sploh ne morejo prodreti v gel. Med migracijo se restrikcijski fragmenti lahko eluirajo (izperejo) v obliki biološko aktivnih dvoverižnih molekul. Geli za barvanje z barvili, ki vežejo DNA, razkrijejo niz trakov, od katerih vsak ustreza restrikcijskemu fragmentu, katerega molekulsko maso je mogoče določiti s kalibracijo z DNA znane molekulske mase.

Primerjava velikosti fragmentov DNA, pridobljenih po obdelavi določene regije genoma z nizom restrikcijskih nukleaz, omogoča izdelavo restrikcijskega zemljevida, ki označuje položaj posameznega restrikcijskega mesta glede na druge regije.

Molekula DNA, dolga 5000 nukleotidnih parov (bp). obdelamo ločeno z restrikcijskima encimoma A in B. Fragmente ločimo z elektroforezo. Encim A je DNK razrezal na 4 fragmente 2100, 1400, 1000 in 500 bp. Obdelava z restrikcijskim encimom B je dala 3 fragmente: 2500, 1300 in 1200 bp. (Slika 37). Za določitev lokacije restrikcijskih mest teh encimov je naslednji korak uporaba dvojnega postopka cepitve – DNK obdelamo z dvema endonukleazama. Obdelava preučevanega fragmenta hkrati z dvema restrikcijskima encimoma je dala 6 fragmentov: 1900, 1000, 800, 600, 500, 200 bp.

riž. 1. Rezultati elektroforeze po obdelavi fragmenta DNA z različnimi restrikcijskimi encimi

Najbolj popolna možnost je, da vsak fragment, ki nastane pri prebavi, eluiramo z enim restrikcijskim encimom in ga nato obdelamo z drugim. Mešanico fragmentov, dobljeno po tej obdelavi, prav tako analiziramo z elektroforezo. V našem primeru smo dobili naslednje rezultate:

Obdelava vsakega od 4 A-fragmentov z restrikcijskim encimom B

2100 - 1900 in 200,

1400 - 800 in 600,

500 - 500 (brez sprememb)

Obdelava vsakega od 3 fragmentov B z restrikcijskim encimom A

2500 - 1900 in 600

1300 - 800 in 500

1200 - 1000 in 200

Analiza rezultatov kaže, da je vsakega od encimov, dobljenih z razgradnjo fragmentov A z restrikcijskim encimom B, mogoče najti v vzorcih, dobljenih z razgradnjo fragmentov B z restrikcijskim encimom A. Ključ do restrikcijskega kartiranja so prekrivajoči se fragmenti. V obravnavanem primeru sta to B-fragment 2100 in A-fragment 2500. Pri obdelavi z drugim restrikcijskim encimom dajeta fragment 1900.

Iz podatkov o razcepljenosti teh fragmentov predvidevamo, da na eni strani na razdalji 200 bp. od fragmenta 1900 je naslednje A-mesto, na drugem koncu pa na razdalji 600 bp. – naslednje mesto B (slika 38). Pri obdelavi z dvema endonukleazama fragment 200 bp. nastane 1-krat, ko ga obdelamo z restrikcijskim encimom A iz B-fragmenta 1200, tj. fragment 1200 leži na levi. Treba je še ugotoviti, kako se zemljevid nadaljuje v desno. Očitno je to A-fragment 1400, saj ga restrikcijski encim B razreže na fragmente 600 in 800. Desno od fragmenta 2500 je očitno treba postaviti fragment 1300. Potem je logično, da obstaja A-fragment 500 in delitev fragmenta B 1300 z restrikcijskim encimom A na 800 in 500.

Pri izdelavi restrikcijskih kart se običajno uporablja več restrikcijskih encimov, zato je treba analizirati kompleksne odnose med fragmenti, ki nastanejo z delovanjem različnih encimov. Za poenostavitev postopka preslikave lahko uporabite nepopolno razdelitev. Pod določenimi pogoji restrikcijski encim ne prepozna in ne razcepi vseh mest v molekuli DNA. Na primer, ko DNA delno prebavi encim A, lahko nastanejo fragmenti 3100 bp in 1400 bp. in 500 bp Če jih primerjamo s podatki o popolni razcepitvi (2100, 1400, 1000 in 500), lahko takoj postavimo 2100 in 1000 enega poleg drugega (fragment 3100). In ko prejmete fragment 3500, postavite 2100 bp v bližini. in 1400 bp.

riž. 2. Analiza restrikcijskih fragmentov in zemljevid fragmentov DNK

Druga tehnika je uvedba radioaktivne končne oznake. Končni fragmenti so v tem primeru določeni z vključitvijo oznake. Fragmente lahko primerjamo tudi s hibridizacijo nukleinske kisline. Prekrivajoči se fragmenti (v tem primeru 2100 in 2500) se bodo hibridizirali.

Prvi zemljevid je bil pridobljen za virus SV40 (opičji virus, ki povzroča maligno preobrazbo), ki vsebuje 5423 baznih parov. Uporabljen je bil restrikcijski encim Hind-II, ki razcepi krožno DNA virusa na 11 fragmentov. Vrstni red njihove razporeditve v DNK je bil ugotovljen s preučevanjem nizov fragmentov, ki nastanejo, ko cepitev napreduje do konca. Prvi prelom je obročasto molekulo spremenil v linearno, ki se je nato razcepila na vse manjše fragmente. Najprej so preučevali nize prekrivajočih se fragmentov, nato pa produkte popolnega cepitve. Na ta način smo dobili restrikcijsko karto krožne virusne DNA, na katero smo nanesli cepitvena mesta restrikcijskih encimov. S ponavljanjem podobnih poskusov z drugim restrikcijskim encimom lahko dobimo podrobnejši zemljevid, kjer so označena številna restrikcijska mesta.

S takimi informacijami je mogoče identificirati biološko pomembne regije na DNK. Ker restrikcijski zemljevid odraža lokacijo specifičnega nukleotidnega zaporedja v dani regiji, nam primerjava takih zemljevidov za dva ali več povezanih genov omogoča oceno homologije med njimi. Z analizo restrikcijskih zemljevidov je mogoče primerjati določene dele DNK različnih živalskih vrst, ne da bi določili njihovo nukleotidno zaporedje. Tako je bilo na primer ugotovljeno, da so kromosomske regije, ki kodirajo verige hemoglobina pri ljudeh, orangutanih in šimpanzih, ostale skoraj nespremenjene v zadnjih 5 do 10 milijonih let (odkar sta se vrsti ločili).

Preslikava omejitev vam omogoča, da vidite velike genetske spremembe, kot so izbrisi ali vstavitve. V tem primeru se restrikcijski fragmenti zmanjšajo ali povečajo, pa tudi izginotje ali pojav restrikcijskih mest.

Ena od tehnik kartiranja je prstni odtis (»fingerprint method« ali DNA-fingerprint). Vključuje uporabo neurejenih in nepopolnih sklopov fragmentov, ki so značilni za genom, čeprav ga ne opiše v celoti.

1.2 Reverzna transkriptaza

Reverzna transkriptaza se uporablja za prepis m-RNK v komplementarno verigo DNK. Pri proučevanju retrovirusov, katerih genom predstavljajo enoverižne molekule RNA, je bilo ugotovljeno, da gre retrovirus med intracelularnim razvojem skozi stopnjo integracije svojega genoma v obliki dvoverižne DNA v kromosome gostitelja. celica. Leta 1964 je Temin postavil hipotezo o obstoju za virus specifičnega encima, ki je sposoben sintetizirati komplementarno DNA na predlogi RNA. Prizadevanja za izolacijo takega encima so bila okronana z uspehom in leta 1970 sta Temin in Mizutani ter neodvisno Baltimore odkrila želeni encim v pripravku zunajceličnih virionov virusa Rousovega sarkoma. Ta od RNA odvisna DNA polimeraza se imenuje reverzna transkriptaza ali revertaza.

Revertaza iz ptičjih retrovirusov je bila najbolj podrobno raziskana. Vsak virion vsebuje približno 50 molekul tega encima. Reverzna transkriptaza je sestavljena iz dveh podenot - a (65 kDa) in b (95 kDa), prisotnih v ekvimolarnih količinah. Reverzna transkriptaza ima vsaj tri encimske aktivnosti:

1) DNA polimeraza, ki uporablja tako RNA kot DNA kot predlogo;

2) aktivnost RNAze H, ki hidrolizira RNA kot del hibrida RNA-DNA, ne pa eno- ali dvoverižne RNA;

3) aktivnost DNA endonukleaze.

Prvi dve aktivnosti sta potrebni za sintezo virusne DNA, endonukleaza pa se zdi pomembna za integracijo virusne DNA v genom gostiteljske celice. Očiščena reverzna transkriptaza sintetizira DNK iz obeh RNA in DNA predlog. Za začetek sinteze reverzetaza, tako kot druge polimeraze, potrebuje kratko dvoverižno regijo (primer). Primer je lahko enoverižni segment tako RNK kot DNK, ki se med reakcijo kovalentno poveže z novo sintetizirano verigo DNK.

riž. 3. Shema za sintezo kopij dvoverižne DNA molekul RNA

Reverzna transkriptaza se uporablja predvsem za prepis messenger RNA v komplementarno DNA (cDNA). Reakcija reverzne transkripcije poteka pod posebej izbranimi pogoji z uporabo močnih zaviralcev aktivnosti RNaze. V tem primeru je mogoče pridobiti kopije DNK v polni dolžini ciljnih molekul RNK. Oligo (dT) se uporablja kot primer za reverzno transkripcijo mRNA, ki vsebuje poli(A), in za molekule RNA, ki nimajo 3"-poli(A) koncev, kemično sintetizirane oligonukleotide, komplementarne 3" koncu RNA. se uporabljajo. Po sintezi komplementarne verige DNA na mRNA in destrukciji RNA (običajno se uporablja alkalna obdelava) se izvede sinteza druge verige DNA. V tem primeru se uporabi sposobnost reverzaze, da tvori samokomplementarne lasnice na 3" koncih enoverižnih cDNA, ki lahko služijo kot primer.

Predloga je prva veriga cDNA. To reakcijo lahko katalizira reverzna reakcija ali DNA polimeraza I E. coli. Dokazano je, da kombinacija teh dveh encimov omogoča povečanje izkoristka popolnih dvoverižnih molekul cDNA. Na koncu sinteze ostaneta prva in druga veriga cDNA kovalentno povezani z zanko lasnice, ki je služila kot primer med sintezo druge verige. To zanko razcepi endonukleaza S1, ki specifično uniči enoverižne dele nukleinskih kislin. Konci, ki nastanejo v tem primeru, niso vedno topi in za povečanje učinkovitosti poznejšega kloniranja se popravijo na topi z uporabo fragmenta Klenow DNA polimeraze I E. coli. Nastalo dvoverižno cDNA lahko nato vstavimo v vektorje za kloniranje, jih razmnožimo kot del hibridnih molekul DNA in uporabimo za nadaljnje raziskave.

1.3 Ligaze

Leta 1961 sta Meselson in Weigle na primeru faga 1 pokazala, da rekombinacija vključuje lomljenje in kasnejše ponovno združevanje molekul DNA. To je pomenilo začetek iskanja encima, ki sodeluje pri navzkrižnem povezovanju fragmentov DNA. Leta 1967 so našli tak encim in ga poimenovali DNA ligaza. Katalizira sintezo fosfodiestrske vezi v 2-verižni molekuli nukleinske kisline.

Z drugimi besedami, DNA ligaze navzkrižno povežejo sosednje nukleotide in tvorijo vez med ostanki sladkorja. DNA ligaze so nujno potrebne v procesih popravljanja DNA, v procesih replikacije - pri podvajanju verige DNA.

Obstajata dve vrsti ligaz DNA, ki se razlikujeta po zahtevah za kofaktorje in načinu delovanja. Ligaza DNA E. coli uporablja difosfopiridin nukleotid kot kofaktor, ligaza faga T4 pa ATP v prisotnosti Mg2+. T4 fag ligaza je bolj univerzalna, saj je poleg ligiranja lepljivih koncev sposobna katalizirati reakcijo ponovnega spajanja dvoverižnih fragmentov DNA s topimi konci. Uporablja se pogosteje.

2 Vnos novega gena v celico

Rekombinantni gen lahko vnesemo v celico na 2 načina: z uporabo vektorjev ali z neposrednim vnosom.

Zahteve za vektorsko DNK, njena sestava

Vektor je molekula DNA ali RNA, sestavljena iz dveh komponent: vektorskega dela (nosilca) in kloniranega tujega gena. Naloga vektorja je dostaviti izbrano DNA v prejemno celico, jo integrirati v genom, omogočiti identifikacijo transformiranih celic in zagotoviti stabilno ekspresijo vnesenega gena.

Tako mora biti vektor majhen, sposoben ohranjanja v gostiteljski celici (repliciran), večkrat kopiran (pomnožen), izražati ustrezen gen (vsebovati ustrezne regulatorne sekvence), imeti mora markerski gen, ki omogoča razlikovanje med hibridne celice za njihovo učinkovito selekcijo; mora biti sposoben prenesti v celico ustreznega organizma.

O regulacijskih sekvencah, ki so odgovorne za stabilno izražanje genov, bomo razpravljali kasneje.

Ločimo lahko dve skupini markerskih genov, ki omogočata razlikovanje transformiranih celic:

1. Selektivni geni, odgovorni za odpornost na antibiotike (kanamicin, tetraciklin, neomicin itd.), herbicide (v rastlinah). To so lahko geni za avksotrofijo nekega substrata itd. Glavno načelo delovanja takšnega markerja je sposobnost transformiranih celic, da rastejo na selektivnem hranilnem mediju z dodatkom določenih snovi, ki zavirajo rast in delitev netransformiranih, normalnih celic.

2. Reporterski geni, ki kodirajo celično nevtralne proteine, katerih prisotnost v tkivih je mogoče enostavno testirati.

Najpogosteje uporabljeni reporterski geni so β-glukuronidaza (GUS), zeleni fluorescentni protein (GFP), luciferaza (LUC) in kloramfenikol acetiltransferaza (CAT). Do danes sta najpogosteje uporabljena gena iz tega arzenala GUS in GFP ter v manjši meri LUC in CAT. GUS, ki se trenutno uporablja kot reporterski gen, je modificiran gen iz bakterije Escherichia coli, ki kodira 68 kDa β-glukuronidazo. GUS je aktiven v širokem razponu okoljskih pogojev z optimumom pri pH 5-8 in 37 °C. Lahko hidrolizira široko paleto naravnih in sintetičnih glukuronidov, kar omogoča izbiro ustreznih substratov za spektrofotometrično ali fluorometrično določanje aktivnosti encimov, pa tudi za in situ histokemično barvanje tkiv (na primer modro). Encim je precej stabilen: odporen je na toploto (razpolovna doba pri 55°C je približno 2 uri) in na delovanje detergentov. Med postopkom zamrzovanja in odmrzovanja ni izgube aktivnosti GUS. V himernih proteinih, ustvarjenih z metodami genskega inženiringa, GUS običajno ohrani svojo funkcionalno aktivnost. V živih celicah je tudi protein GUS zelo stabilen in aktiven od nekaj ur do nekaj dni.

GFP (green fluorescent protein - zeleni fluorescentni protein ali zeleni fluorescentni protein) so odkrili Shimomura et al. leta 1962 v svetleči meduzi Aequorea victoria. Gen GFP so leta 1992 klonirali Prasher et al. in v nekaj letih se je začela aktivna uporaba tega gena kot reporterskega gena pri delu z različnimi pro- in evkariontskimi organizmi. Trenutno se gen GFP uporablja v stotinah študij po vsem svetu in njihovo število hitro narašča. torej hitra rast klical posebne lastnosti GFP protein, in sicer njegova sposobnost fluoresciranja v vidnem (zelenem) območju spektra ob obsevanju z dolgovalovnim UV. To fluorescenco povzroči neposredno protein in za njeno manifestacijo ne potrebuje substratov ali kofaktorjev. Zahvaljujoč tej lastnosti je gen GFP zelo obetaven reporterski gen, ki omogoča različne intravitalne (nedestruktivne) študije s transgenimi organizmi.

Številni derivati GFP se skupaj imenujejo AFP (avtofluorescentni proteini). Iz morske vetrnice Discosoma sp. Nedavno je bil izoliran še en protein, DsRed, ki fluorescira v rdeči svetlobi. Znanstveniki Ruske akademije znanosti so nedavno izolirali več podobnih fluorescenčnih proteinov iz različnih koralnih polipov reda Anthozoa. Lahko se zelo denaturira visoka temperatura, ekstremne vrednosti pH ali močna redukcijska sredstva, kot je Na2SO4. Ko se vrne v fiziološke pogoje, GFP v veliki meri ponovno pridobi svojo sposobnost fluorescence. V himernih proteinih, ustvarjenih z metodami genskega inženiringa, GFP običajno ohrani svojo funkcionalno aktivnost. V živih celicah je tudi protein GFP zelo stabilen.

CAT – geni odgovorni za sintezo kloramfenikol acetiltransferaze (izolirana iz Escherihia coli). Ta encim katalizira prenos acetilne skupine iz acetil-CoA na kloramfenikol. Določimo ga histokemično s spremembo barve tkiva ob dodatku ustreznega substrata.

LUC – gen kodira encim luciferazo (kloniran iz bakterij in kresnic). Povzroči, da transformirane celice žarijo. Bakterijski encim je sestavljen iz dveh podenot. Za določanje aktivnosti encimov je potrebna posebna oprema - fluorimeter in digitalna video kamera z ojačevalnikom svetlobnega signala. Encim izgubi aktivnost, ko je izpostavljen detergentom in povišanim temperaturam. Zamenjava selektivnih genov z reporterskimi geni je pri izbiri transgenih rastlin pogosto zelo zaželena, saj je možnost morebitnega tveganja za okolje in zdravje ljudi pri uporabi reporterskih genov praktično izključena. Vendar pa je obseg reporterskih genov širši kot le nadzor nad transgenezo. Drugi in očitno pomembnejši namen reporterskih genov je razkriti (čim bolj kvantitativno) časovne in prostorske vzorce izražanja danega gena, bodisi lastnega bodisi tujega. Že samo pritrditev reporterskega gena na promotorsko regijo omogoča študij čista oblika"njegova vloga pri uravnavanju izražanja preučevanega gena na ravni transkripcije.

Zamenjava regije, ki kodira beljakovine v genu, z reporterjem ob ohranjanju regije, ki kodira 5"-terminalno neprevedeno zaporedje mRNA, nam omogoča, da ocenimo vlogo tega zaporedja v procesih transporta mRNA iz jedra v citoplazmo. in začetek prevajanja.

Ena najpomembnejših lastnosti gena je njegova sposobnost izražanja. Za to lastnost so odgovorni različni genetski elementi, ki jih moramo vgraditi v vektorsko molekulo, ki nosi gen.

2.1 Regulacija izražanja genov pri prokariontih

Mnogi bakterijski geni so zasnovani tako, da lahko delujejo z bistveno drugačno učinkovitostjo. V E. coli se na primer relativna abundanca različnih proteinov zelo razlikuje (od manj kot 0,1 % do 2 %), odvisno od njihovih funkcij; Poleg tega je vsak protein v kromosomu E. coli kodiran z enim genom. Takšne variacije so posledica delovanja sistema za nadzor genske ekspresije, ki se izvaja predvsem na ravni transkripcije DNA. Tako je najpogosteje stopnja genske aktivnosti povezana s količino sintetizirane mRNA, to je z aktivnostjo encima RNA polimeraze.

Zaporedja DNA, ki se nahajajo pred začetkom strukturnega gena in določajo stopnjo aktivnosti RNA polimeraze, se imenujejo regulatorna zaporedja. Eno od teh zaporedij je regija DNA, na katero se veže RNA polimeraza. Ta regija se imenuje promotor.

Zaporedje promotorskih baz določa frekvenco iniciacije sinteze mRNA in zamenjava ene baze v tem zaporedju lahko povzroči 1000-kratno zmanjšanje frekvence iniciacije.

Promotor je lahko močan ali šibek. Močan promotor pogosto sproži sintezo mRNA, šibek promotor veliko redkeje. Po drugi strani pa je promotor lahko reguliran ali nereguliran. Na primer, promotor β-laktamaze je nereguliran, vendar močan. Uporaba takih promotorjev ni vedno priročna. Dejstvo je, da lahko velike količine beljakovin blokirajo rast bakterij. Poleg tega lahko prekomerna transkripcija rekombinantne DNA moti replikacijo plazmida in ta se izgubi. Zato je bolj priročno uporabiti regulirane močne promotorje (inducibilne), katerih vključitev in s tem sintezo tujega proteina se lahko izvede, ko se pridobi velika bakterijska masa.

Nekateri plazmidni vektorji vsebujejo promotor, katerega delovanje uravnava temperaturno občutljiv proteinski produkt represorskega gena. Represorski protein je aktiven pri določenih temperaturah in blokira delovanje promotorja. S povišanjem temperature na 42 °C lahko "vklopite" promotor in hitro pridobite veliko količino potrebnih beljakovin.

Kot inducibilne promotorje se uporabljajo tudi Trp promotor operona triptofana, ki je reguliran s stradanjem triptofana, promotor lac operona laktaze, ki ga inducira substrat (laktoza) in drugi.

Intenzivnost transkripcije določenih strukturnih genov je lahko odvisna od učinkovitosti njene terminacije, zlasti od tega, kako pogosto RNA polimeraza ustavi sintezo RNA, preden doseže te gene. Relativno nedavno je bilo odkrito, da v mnogih operonih E. coli, ki nadzorujejo biosintezo aminokislin, obstaja terminacijsko zaporedje med promotorjem in prvim strukturnim genom. Pod določenimi pogoji nastane terminacijski signal, ki oslabi intenzivnost prepisovanja.

Ta pojav imenujemo atenuacija, odsek DNK pa atenuator (atenuator). Tako kot represija je tudi atenuacija odvisna od prisotnosti ustreznih aminokislin v okolju. Na primer, presežek triptofana v celicah od triptofana odvisnih mutantov z okvarjenim represorjem, le 1 od 10 molekul RNA polimeraze, ki začnejo transkripcijo, premaga atenuator in prebere gensko strukturo. Odstranitev triptofana potroji učinkovitost prepisovanja genov. Za razliko od represije, antenuacija ni odvisna od same aminokisline, ampak od triptofanil-tRNA (aminokislina, vezana na ustrezno tRNA).

Na produktivnost učinkovitosti rekombinantne DNK pomembno vpliva število kopij te DNK na celico. Celotna aktivnost izraženega gena narašča z naraščajočim številom kopij plazmida. Tako je z uporabo multikopirnih plazmidov mogoče doseči supersintezo želenih beljakovinskih produktov. Običajno uporabljeni plazmidni vektorji (pBR 322 itd.) se vzdržujejo v celici v količini 20-50 kopij. Zdaj imajo raziskovalci na voljo temperaturno občutljive mutirane plazmide, ki lahko kopičijo do tisoč do dva tisoč kopij na celico, ne da bi motili njene vitalne funkcije. Na ta način je mogoče doseči prekomerno proizvodnjo plazmidnih genov s prekomerno proizvajajočimi sevi bakterij.

Regulacija izražanja pri E. coli poteka tudi na ravni prevajanja. Zaporedje baz, dolgo 6-8 nukleotidov, ki se nahaja tik pred začetnim kodonom AUG, določa učinkovitost prevajanja. To zaporedje predstavlja mesto vezave mRNA na ribosom. Praviloma se nahaja 8 nukleotidov od začetnega kodona, njegov premik v eno ali drugo smer pa lahko močno zmanjša učinkovitost prevajanja ustrezne mRNA. Opisano regijo imenujemo Schein-Dalgarnovo zaporedje, poimenovano po raziskovalcih, ki so jo prvi identificirali.

Med drugim mora vektor vključevati markerski gen, ki omogoča selekcijo spremenjenih celic. Pogosto se kot selektivni uporabljajo geni za v naravi razširjene encime, ki spreminjajo antibiotike in onemogočajo njihovo delovanje.

Značilnosti organizacije evkariontskega genoma

Pri evkariontskih organizmih je mehanizem regulacije transkripcije veliko bolj zapleten. Kot rezultat kloniranja in sekvenciranja evkariontskih genov so odkrili specifične sekvence, ki sodelujejo pri transkripciji in translaciji.

Za evkariontsko celico je značilno:

1. Prisotnost intronov in eksonov v molekuli DNA.

2. Zorenje mRNA - ekscizija intronov in šivanje eksonov.

3. Prisotnost regulatornih elementov, ki uravnavajo transkripcijo, kot so: a) promotorji - 3 vrste, od katerih je vsak zaseden s specifično polimerazo. Pol I replicira ribosomske gene, Pol II replicira proteinske strukturne gene, Pol III replicira gene, ki kodirajo majhne RNA. Promotorja Pol I in Pol II se nahajata pred mestom iniciacije transkripcije, promotor Pol III je znotraj strukturnega gena; b) modulatorji - zaporedja DNA, ki povečajo stopnjo transkripcije; c) ojačevalci - zaporedja, ki povečajo stopnjo transkripcije in delujejo ne glede na njihov položaj glede na kodirni del gena in stanje izhodišča sinteze RNA; d) terminatorji – specifične sekvence, ki ustavijo tako prevajanje kot prepisovanje.

Ta zaporedja so primarna struktura in lokacija glede na iniciacijski kodon se razlikujejo od prokariontskih in jih bakterijska RNA polimeraza ne »prepozna«. Tako morajo biti za izražanje evkariontskih genov v prokariontskih celicah geni pod nadzorom prokariontskih regulatornih elementov. To okoliščino je treba upoštevati pri konstruiranju ekspresijskih vektorjev.

2.2 Metode neposrednega vnosa gena v celico

Neposredni vnos gena v celico poteka na več načinov:

1. Transfekcija

2. Mikroinjekcija

3. Elektroporacija

5. Pakiranje v liposome

6. Elektronska pištola

Med transfekcijo se DNA adsorbira na kristale kalcijevega fosfata (Graham Van der Eb, 1973). Nastanejo delci kalcijeve oborine. Celica jih prevzame s fagocitozo.

Za povečanje učinkovitosti transformacije se specifični DNK, ki vsebuje gen, za katerega se bo izbirala, doda nespecifični nosilec DNK. Običajno se v ta namen DNK vzame iz telečjega timusa ali sperme lososa. Del DNK se veže na membrano in ne vstopi v celice. DNK sprejme od 15 do 90 % celic. Nekaj dni po dajanju je majhen delež celic sposoben izražati tuje gene, nato pa nivo izražanja pade in 10-3 - 10-5 celic je podvrženih bolj ali manj stabilni transformaciji.

Vsak gen lahko vnesemo v celice, če ga predhodno povežemo s kloniranim selektivnim markerjem. Vendar pa so nadaljnje študije pokazale, da povezovanje zunaj celice ni potrebno. Celice, ki absorbirajo selektivni gen, absorbirajo tudi drugo DNK, ki je prisotna v kalcijevi oborini. Tako lahko z uporabo metode kotransformacije skoraj vsak segment klonirane DNA vnesemo v kultivirane evkariontske celice, če je ta DNA skupaj s selektivnim markerjem vključena v mešanico, da se tvori kalcijeva oborina.

Vse celice niso sposobne preoblikovati genomske DNK pri visokih frekvencah. Človeški fibroblasti učinkovito vključujejo plazmidno DNA in komajda vključujejo genomsko DNA.

Mikroinjektiranje DNK v celice sesalcev je postalo možno s prihodom naprave za izdelavo mikropipet s premerom 0,1-0,5 mikronov in mikromanipulatorja (slika 45). Tako so v celice TK vbrizgali plazmide, ki so vsebovali fragment virusa herpesa z genom za timidin kinazo (TK) in plazmid pBR322 in pokazali, da je gen TK prodrl v jedra in se v njih normalno razmnoževal. Metodo vnosa DNK z uporabo mikroinjekcije sta v zgodnjih 70. letih razvila Anderson in Diakoumacos. Načeloma lahko z dobro opremo v 1 uri vbrizgamo 500-1000 celic, v najboljših poskusih pa opazimo stabilno integracijo in izražanje vbrizganih genov v 50% celic. Prednost opisane metode je tudi v tem, da omogoča vnos katere koli DNK v poljubne celice in ni potreben selektivni pritisk za vzdrževanje vnesenega gena v celicah.

riž. 4. Vnos DNK z mikroinjiciranjem

Elektroporacija temelji na dejstvu, da visokonapetostni impulzi reverzibilno povečajo prepustnost biomembran. Celice in fragmente DNA, ki jih je treba vnesti v celice, dodamo v medij za elektroporacijo (slika 46). Visokonapetostni impulzi (napetost 200 - 350 V, trajanje impulza 54 ms) prehajajo skozi medij, kar povzroči nastanek por (električni razpad) v citoplazemski membrani, katerih življenjska doba in velikost zadostujeta za makromolekule, kot je DNA. vstopiti v celico iz zunanjega okolja kot posledica osmotskih sil. Hkrati se poveča volumen celice.

riž. 5. Metoda elektroporacije

"Mini celice" se pridobijo z blokiranjem mitoze donorskih celic s kolcemidom. Pri dolgotrajni obdelavi celic s kolcemidom se okoli vsakega kromosoma oblikuje nova jedrska membrana. Obdelava s citohalazinom B in centrifugiranje povzroči nastanek mini celic, ki predstavljajo mikronukleuse, inkapsulirane v citoplazmatski membrani.

Nastale mini celice so zelo občutljive na različne vrste vplivov, zato so za fuzijo izbrani posebni blagi pogoji. Metoda je težka, kapricična, nizka učinkovitost - 10-6 - 10-7.

Pakiranje v liposomih se uporablja za zaščito eksogenega genskega materiala pred uničujočim delovanjem restrikcijskih encimov.

Liposomi so sferične lupine, sestavljene iz fosfolipidov. Dobimo jih z močnim stresanjem zmesi vodne raztopine in lipidov ali z obdelavo vodnih emulzij fosfolipidov z ultrazvokom. Za vnos DNK v živalske in rastlinske celice so najprimernejši liposomi, sestavljeni iz fosfatidilserina in holesterola. Sistemi prenosa liposomov so nizko toksični za celice.

Metoda biološke balistike (biolistike) je danes ena najučinkovitejših metod preobrazbe rastlin, predvsem enokaličnic.

2.3 Metode neposrednega vnosa gena v celico

Trenutno je bakterija E. coli najbolj raziskana celica od vseh. Za večino najbolj raziskanih fagov je gostiteljska celica tudi E. coli.

Protoplast E. coli je obdan z mureinsko vrečko, ki meji na zunanjo membrano. E. coli se nanaša na mikroorganizme, ki nimajo fiziološke sposobnosti za absorpcijo eksogene DNA. Zato je treba ustvariti pogoje, ki omogočajo premagovanje ovire celične stene. Prvič, sferoplaste dobimo z obdelavo celic z lizocimom v izotonični raztopini.

Lipopolisaharidno plast zunanje membrane gramnegativne bakterije stabilizirajo dvovalentni kationi, zato za rahljanje zunanje membrane E. coli uporabimo kompleksno sredstvo etilendiamintetraocetna kislina (EDTA), ki veže dvovalentne katione. Pri obdelavi z EDTA se nekateri lipopolisaharidi sprostijo iz zunanje membrane celice in lizocim lahko doseže mureinsko vrečko in jo hidrolizira. To vodi do povečane prepustnosti celične membrane. Izboljšave metod za pridobivanje sferoplastov E. coli in njihovo transfekcijo so omogočile doseganje zadostnih visoka učinkovitost transformacija z molekulami DNA različnih fagov.

Ugotovljeno je bilo, da na infektivnost pomembno vpliva oblika fagnih molekul DNK, ki jih ti zavzamejo in vivo. Za najvišjo transfekcijsko učinkovitost so značilni fagi s krožno ali linearno, a hitro zapirajočo se DNA (lamboidni fagi).

Uspešni poskusi na E. coli so postali spodbuda za izvajanje podobnih študij z drugimi prokariontskimi organizmi. Največji uspehi so bili doseženi s celicami Bacillus subtilis. B. subtilis je nepatogen talni mikroorganizem, ki raste v strogo aerobnih pogojih. Bacili ne proizvajajo toksinov in so nepatogeni ne za živali ne za ljudi, celična stena E. coli pa vsebuje endotoksin, ki ga je precej težko ločiti od gensko spremenjenih produktov. Poleg tega ima celična stena bacilov preprosta struktura in bakterije lahko izločajo veliko beljakovin v tekočino kulture. 20 različnih vrst bacilov izloča v tekočino kulture več kot 40 encimov z zunajcelično lokalizacijo. E. coli izloča v gojišče relativno malo proteinov, njihova izolacija in čiščenje pa je težavno. Plazmide in fage so našli tudi v bacilih, ki so zdaj dobro raziskani.

Tuji geni so klonirani v tako imenovane shuttle vektorje. Ti vektorji se enako uspešno razmnožujejo v celicah več gostiteljev, v tem primeru v celicah E. coli in B. subtilis. Vektorji so bili pridobljeni z in vitro kombinacijo fragmentov teh plazmidov.

Geni E. coli s svojimi regulatornimi regijami ne delujejo v B. subtilis, zato so bile uporabljene lastne homologne regije B. subtilis.

Za konstruiranje rekombinantne DNA, ki vsebuje gen, ki ga je treba izraziti, sledimo naslednji strategiji. cDNA se sintetizira ali celice, ki nosijo fragment genoma z želenim genom, izolirajo iz knjižnice klonov in klonirajo v ustreznem vektorju. Fragmenti genomske DNK so modificirani - iz njih so odstranjeni nekodirajoči predeli in deli sosednjih genov. Ta operacija pogosto zahteva sekvenciranje tega fragmenta DNK. Nato se konstruirajo vmesne rekombinantne DNK, v katerih je gen postavljen pod nadzor bakterijskih regulatornih elementov (promotor, operater, vezavna točka ribosoma). Ti regulatorni elementi so izolirani iz hibridnih plazmidov, zasnovanih posebej kot viri regulatornih elementov. Nastali konstrukt se vstavi v ustrezen vektor, na primer pBR 322, in gen se izrazi v bakterijski celici.

Vendar pa je primerneje gen integrirati v poseben ekspresijski vektor, ki že vsebuje regulatorne elemente, ki zagotavljajo aktivno ekspresijo po vnosu rekombinantnega plazmida v bakterijsko celico. Takšne učinkovite regulatorne regije vključujejo na primer močan promotor gena beta-laktamaze (gen za odpornost na penicilin, del plazmida pBR 322). Številni geni, vključno z genom za inzulin, so bili vstavljeni v restrikcijsko mesto Pst I, ki se nahaja v strukturnem delu gena. Promotor tega gena zagotavlja učinkovito prepisovanje, ki se nadaljuje, dokler RNA polimeraza ne doseže terminacijskega signala vstavljenega gena.

Primer vektorskega označevanja so prvi poskusi z E. coli, natančneje z enim od njenih plazmidov pBR322, ki jih je izvedel Gilbert za proizvodnjo inzulina. Plazmid pBR322 vsebuje 2 gena, ki določata odpornost na ampicilin in tetraciklin. Restrikcijski encim PstI cepi plazmid v srednjem delu gena, ki kodira encim za odpornost proti apicilinu. Po razcepu plazmida na njegovih koncih s terminalno transferazo smo dodali zaporedje štirih nukleotidov z ostanki gvanina. Nato so, kot običajno, gen za proinzulin "všili" z uporabo ligaz in tako dobili rekombinantno DNA. Fragment DNA, integriran v plazmid, je motil sintezo encima, ki uničuje ampicilin, vendar je gen, ki zagotavlja odpornost na tetraciklin, ostal aktiven. Tako transformirane celice E. coli so sintetizirale hibridni protein, ki je vseboval sekvenci penicilaze in proinzulina, tako da je bil s cepitvijo penicilaze in srednjega segmenta proinzulina pridobljen biološko aktiven insulin.

Po drugi strani pa, če delček tuje DNK vstavimo v enega od genov za odpornost, se slednji inaktivira. Posledično je uspešno integracijo tujega fragmenta DNK v enega od teh genov zlahka zaznati z izginotjem odpornosti na ta antibiotik pri bakterijah.

2.4 Vnos genov v celice sesalcev

Manipulacijo celic sesalcev lahko razdelimo na 2 velike skupine: poskusi s somatskimi celicami in poskusi transformacije zarodnih celic. V slednjem primeru je končni rezultat proizvodnja transgenih organizmov.

Značilnosti vektorjev za prenos genov v živalske celice

Nekateri najboljši nosilci za vnos tujih informacij v živalsko celico so vektorji na osnovi retrovirusov, na primer na osnovi virusa mišje levkemije. Zagotavljajo zelo učinkovit prenos genov in njihovo stabilno integracijo v kromosom ciljnih celic. V bistvu transformacije živalskih celic potekajo bodisi s pomočjo retrovirusov (približno 40 % vseh transformacij) bodisi z pakiranjem DNA v liposome (25 %), redkeje se uporabljajo adenovirusi, saj lahko povzročijo močan imunski odziv, pri Poleg tega je njihova ponovna uvedba nemogoča.

Če je bil problem dostave tuje DNA in vitro praktično rešen in je bila njena dostava v tarčne celice različnih tkiv in vivo uspešno rešena (predvsem z ustvarjanjem konstruktov, ki prenašajo receptorske proteine, vključno z antigeni, specifičnimi za določena tkiva), potem druge značilnosti obstoječih vektorskih sistemov - stabilnost integracije, regulirano izražanje, varnost - še vedno zahtevajo resne izboljšave.

Najprej gre za stabilnost integracije. Do sedaj je bila integracija v genom dosežena le z uporabo retrovirusnih ali adeno-povezanih vektorjev. Učinkovitost stabilne integracije je mogoče povečati z izboljšanjem genskih konstruktov, kot so sistemi, posredovani z receptorji, ali z ustvarjanjem dovolj stabilnih episomalnih vektorjev (to je struktur DNK, ki so sposobne dolgotrajne obstojnosti znotraj jeder).

V zadnjem času je posebna pozornost namenjena ustvarjanju vektorjev na osnovi umetnih kromosomov sesalcev (MAC). Zaradi prisotnosti osnovnih strukturnih elementov navadnih kromosomov se takšni mini kromosomi dolgo časa zadržijo v celicah in so sposobni prenašati genome v polni velikosti in njihove naravne regulatorne elemente, ki so potrebni za pravilno delovanje gena, v pravem tkivu in ob pravem času. Takšni umetni kromosomi so bili že ustvarjeni za kvasovke (YAK), saj je bil genom kvasovk v celoti preslikan.

Za prepoznavanje spremenjenih celic so potrebni markerji. Če se somatske celice transformirajo, se običajno uporabljajo selektivni markerji. Axel in sodelavci s Columbia University College of Medicine and Surgery so na ta način popravili genetsko napako v mišjih celicah. Vzeli so fragment DNK, ki vsebuje gen za timidin kinazo (TK), ki izhaja iz virusa herpesa, zmešali to DNK z nekaj miligrami nosilne DNK iz lososove sperme in DNK nanesli na kulturo mišjih L celic, ki niso imele TK gen (TK-). S frekvenco 1 na 100.000 so celice pridobile gen TK, zato so na selektivnem gojišču, ki ni dovoljevalo rasti celic TK, celice TK+ rasle in se razmnoževale normalno.

Drugi izbirni marker, gen, ki kodira dihidrofolat reduktazo (DHFR), se lahko uporablja pri transformaciji nemutantnih celičnih linij. Zaradi izražanja številnih kopij tega gena živalska celica skupaj s plazmidom pridobi odpornost na visoke koncentracije inhibitorja encima in tako lahko transformante selekcioniramo pri visokih koncentracijah inhibitorja.

Razvita sta bila še dva univerzalna vektorja, ki vsebujeta genske markerje, ki delujejo v normalnih celicah. Zgrajeni so po istem principu: prokariontski geni, ki določajo fenotip transgenih celic, so povezani z evkariontskimi regulatornimi signali.

Eden od vektorjev je sestavljen iz prokariontskega gena za odpornost na antibiotik neomicin, vstavljenega v zgodnjo regijo genoma SV-40. Evkariontske celice so občutljive na analog neomicina G 418, ki ga genski produkt inaktivira. Tako transfektirane celice pridobijo sposobnost rasti na mediju, ki vsebuje G 418.

2.5 Genetska transformacija somatskih celic sesalcev

Kulture transformiranih celic sesalcev se uporabljajo za pridobivanje različnih snovi. Čeprav so kulture živalskih celic, zlasti če se gojijo v velikem obsegu, veliko manj ekonomične kot kulture bakterijskih kvasovk, imajo pomembno prednost – možnost izvajanja majhnih, a zelo pomembnih modifikacij proteinov – genskih produktov sesalcev. Na primer, za učinkovito delovanje številnih beljakovin je treba nanje pritrditi verige molekul ogljikovih hidratov ali lipidov. Tvorba in pritrditev takih verig je običajen proces za celice sesalcev, medtem ko bakterijska celica ni sposobna narediti takšnih sprememb.

Transformacija somatskih celic sesalcev poleg ustvarjanja celic proizvajalcev omogoča preučevanje subtilnih mehanizmov regulacije izražanja genov in namensko spreminjanje genetskega aparata živalskih celic in po potrebi človeških celic, kar je zelo pomembno. pomen za medicinsko genetiko.

Celične kulture sesalcev so lahko učinkovit vir za izolacijo določenih virusnih antigenov za namene pridobivanja cepiv za živali in ljudi. Proizvodnja takšnih celičnih kultur cepiva je izvedljiva z uporabo tehnologije rekombinantne DNA in učinkovitih ekspresijskih vektorjev za celice sesalcev in ljudi. Pri uporabi DNK cepiv v telo ne vnašamo antigena, temveč gen, ki kodira sintezo tega antigena. Gen vstavimo v plazmid, plazmid pa vnesemo v telo z navadno injekcijo.

DNK cepiva imajo dobre obete v živinoreji. Vlaknine so beljakovine virusne ovojnice. Epitop vlaken kodira sintezo zaščitnih protiteles. Eno od bolezni ptic, sindrom zmanjšane proizvodnje jajc (DEL), povzroča virus. Po analizi DNK tega virusa so vlakno, ki kodira gen, izolirali, klonirali in vstavili v plazmid. Rekombinantno cepivo, ko ga vnesemo v telo, bo v celico prineslo DNA vlaken, proizvodnja virusnega proteina bo izzvala sintezo specifičnih protiteles, tj. povzročila bo imunski odziv.

Prednost takšnih cepiv je njihova zelo majhna prostornina - za imunizacijo ene miši zadostuje 10-50 μg plazmida, za eno kravo pa 200-300 μg. Plazmid ostane v telesu do 1 leta. DNK cepiva proti mikoplazmam, povzročiteljem tuberkuloze, salmoneloze in lišmanioze, so trenutno v fazi kliničnega preskušanja.

Razvoj malignega tumorja v telesu običajno zavre imunski sistem. Težava je okrepiti imunski sistem kot celoto in usmeriti njegovo delovanje proti rakavim celicam. Raziskovalci iz Ann Arbor School of Medicine (Michigan) so prišli do metode za boj proti raku. V tumorske celice debelega črevesa poskusnih miši smo vnesli gene, ki kodirajo proteine iz drugega seva miši. To je mogoče storiti z uporabo liposomov ali virusa. Po nastopu na zunaj celično membrano teh proteinov, je imunski sistem napadel takšne celice. 20% bolnih miši je ozdravelo, pri 70% se je tumor zmanjšal, v kontrolni skupini pa so vsi poginili. Limfociti se niso borili le proti »označenim« tumorskim celicam, temveč tudi proti metastatskim celicam, zato se je imunski sistem »prebudil«. Trenutno potekajo poskusi na ljudeh s kožnim rakom.

2.6 Genska terapija

Zdravljenje bolezni z uporabo genov imenujemo genska terapija. Trenutno je na svetu okoli 400 projektov, namenjenih zdravljenju z gensko terapijo.

Pred razvojem programa genske terapije je potrebna temeljita analiza tkivno specifične ekspresije ustreznega gena, identifikacija primarne biokemične okvare, študija strukture, delovanja in znotrajcelične porazdelitve njegovega proteinskega produkta ter biokemična analiza. patološki proces. Vsi ti podatki se upoštevajo pri izdelavi ustreznega medicinskega protokola.

Testiranje postopka genske korekcije dedne bolezni poteka na primarnih celičnih kulturah bolnika, v katerih je ta gen normalno funkcionalno aktiven. S pomočjo teh celičnih modelov se oceni učinkovitost izbranega eksogenega prenosnega sistema DNK, določi ekspresija vnesenega genskega konstrukta, analizira njegova interakcija s celičnim genomom in razvijejo korekcijske metode na biokemični ravni. Z uporabo celičnih kultur je možno razviti sistem za ciljno dostavo rekombinantne DNK, vendar pa je testiranje zanesljivosti delovanja tega sistema možno le na ravni celotnega organizma. Zato je taka pozornost v programih genske terapije namenjena in vivo poskusom na naravnih ali umetno pridobljenih modelih ustreznih dednih bolezni pri živalih.

Uspešen popravek genetske okvare pri takih živalih in odsotnost neželenih stranskih učinkov genske terapije je ključni predpogoj za omogočanje kliničnih preskušanj. Tako standardna shema za gensko korekcijo dedne napake vključuje vrsto zaporednih faz. Začne se z ustvarjanjem popolnoma delujočega (izraženega) genetskega konstrukta, ki vsebuje semantične (kodirajoče beljakovine) in regulatorne dele gena. Na naslednji stopnji se reši problem vektorja, ki zagotavlja učinkovito in, če je mogoče, ciljno dostavo gena v ciljne celice. Nato se izvede transfekcija (prenos nastalega konstrukta) v ciljne celice, učinkovitost transfekcije, stopnja popravljivosti primarne biokemične napake v pogojih celične kulture (in vitro) in, kar je najpomembneje, in vivo v živalskih bioloških modelih. ocenjeno. Šele po tem se lahko začne program kliničnega preskušanja.

Obstajata dve vrsti genske terapije: nadomestna in korektivna.

Gensko nadomestno zdravljenje vključuje vnos nedotaknjenega gena v celico. Vnesena kopija bo nadomestila funkcijo okvarjenega gena, ohranjenega v pacientovem genomu. Vsa klinična testiranja, ki se danes izvajajo, vključujejo vnos dodatnih količin DNK v celico.

Korektivna terapija vključuje zamenjavo okvarjenega gena z normalnim zaradi rekombinacije. Ta metoda je trenutno v fazi laboratorijskega testiranja, saj je njena učinkovitost še zelo nizka.

Glede na način vnosa eksogene DNK v pacientov genom se lahko genska terapija izvaja v celični kulturi (ex vivo) ali neposredno v telesu (in vivo). Celična genska terapija ali terapija ex vivo vključuje izolacijo in gojenje bolnikovih specifičnih tipov celic, vnos tujih genov vanje, izbiro transfektiranih celic in njihovo ponovno infuzijo istemu bolniku.

Primer je zdravljenje kombinirane imunske pomanjkljivosti. Kombinirana imunska pomanjkljivost je lahko posledica okvare gena za adenozin deaminazo. Prvi poskus zdravljenja takšnega bolnika z metodami genske terapije je bil v ZDA leta 1990. Bolnemu otroku so odstranili T-limfocite, jih transformirali z retrovirusnim vektorjem in vnesli normalen gen za adenozin deaminazo, celice pa vrnili v telo. Uvod je treba ponoviti. Podobna transformacija matičnih celic kostnega mozga je učinkovitejša.

Genska terapija in vivo temelji na neposrednem vnosu kloniranih in pakiranih zaporedij DNA v specifična tkiva bolnika. Trenutno ni javno dostopne metode za gojenje pljučnih celic, zato je pri pljučnih boleznih edini način za dostavo tujega gena ta, da ga vnesemo neposredno v telo. Cistična fibroza je zelo pogosta huda dedna pljučna bolezen pri pripadnikih bele rase, ki prizadene npr. Srednja Evropa en novorojenček od 2500 in pri katerem je bil identificiran okvarjen gen, ki kodira protein regulatorja transmembranske prevodnosti. Glavna manifestacija okvarjenega gena je pljučnica. Prizadete so vse epitelne celice. Glavni problem je, kako gen dostaviti v celice, prekrite s sluzjo, ki onemogoča transformacijo. Nepoškodovano kopijo "gena bolezni", vključenega v adenovirusni vektor ali liposom, se v obliki aerosola daje v Airways bolan.

Za odpravo motnje s progresivnim mišična distrofija Pri Duchennu (dečkova bolezen, povezana z okvarami kromosoma X) so poskusili vbrizgati normalni gen, ki kodira protein distrofije, neposredno v mišična vlakna z uporabo bodisi »gole« DNK bodisi adenovirusnega vektorja. Drugi raziskovalci so bolniku po genetski korekciji presadili mioblaste. Prej negibni otrok je pridobil sposobnost gibanja! Na žalost je v vseh teh poskusih mogoče pridobiti le začasne terapevtski učinek, postopek vnosa gena pa je treba večkrat ponoviti.

Seznam dednih bolezni, ki jih poskušajo ali načrtujejo zdraviti z geni, je dolg. Sem spadajo revmatoidni artritis, fenilketonurija in bolezni, povezane s pomanjkanjem hormonov (insulin, eritropoetin, rastni hormon). V primeru kronične anemije, povezane s pomanjkanjem eritropoetina, je na podlagi poskusov na živalih predlagan bistveno nov pristop k zdravljenju. Ker vsaka naša celica vsebuje enak genom, je mogoče prisiliti kožne fibroblaste, ki običajno ne proizvajajo eritropoetina, da sintetizirajo ta hormon. Za to je treba v genom vnesti novo kontrolno regijo in s tem odpraviti prepoved branja (izražanja) gena za eritropoetin, ki je v fibroblastih prisoten, a »molči«.

Skoraj na vseh področjih medicine so se bodisi začela klinična preskušanja zdravljenja dednih bolezni z uporabo genske terapije bodisi se pristopi k takemu zdravljenju razvijajo v poskusih na živalih. Z izboljšanjem metod dostave genov in nadzora njihovega izražanja se bo seznam bolezni, pri katerih je mogoče uporabiti gensko zdravljenje, zagotovo razširil.

Uporaba genske terapije za zdravljenje raka odpira ogromne možnosti. Dolgoletna prizadevanja znanstvenikov so pripeljala do spoznanja, da je rak genetska bolezen in da njegov razvoj poteka v več fazah, kot posledica niza genetskih motenj, ki se kopičijo v celici. Zato lahko vsak od teh posameznih genetskih učinkov postane tarča pristopa genske terapije.

2.7 Vzreja transgenih živali

Če DNK vnesemo v celice večceličnega organizma, bo rezultat transformacije sprememba lastnosti le majhnega števila celic, ki so pridobile nov gen ali gene. Zato je za spremembo lastnosti celotnega organizma potrebno spremeniti genom zarodnih celic, ki bodo nove lastnosti prenesle na potomce. Pri rastlinah in živalih je priporočljivo spremeniti lastnosti, kot so hitrost rasti, odpornost proti boleznim in sposobnost prilagajanja novim zunanjim razmeram. V tem primeru lahko kot označevalce uporabimo polimorfizem dolžine restrikcijskih fragmentov (AFLP), minisatelitno analizo, mikrosatelitno analizo DNA (SSR), hibridizacijo itd.

Razvite so bile metode za vnos genov v embrionalne celice sesalcev, muh in nekaterih rastlin. Od dela s precej velika jajca dvoživke prešli na študij jajčec in zarodkov miši, ki predstavlja genetsko najbolj raziskanega sesalca.

Mikroinjekcija kloniranih genov se izvede v enega ali oba pronukleusa na novo oplojenega mišjega jajčeca. Pogosteje se izbere moški pronukleus, ki ga vnese sperma, saj je njegova velikost večja. Po injiciranju se jajčece takoj implantira v jajcevod posvojitvene matere ali pusti, da se razvije v kulturi do stopnje blastociste, nato pa se implantira v maternico.

V semenčice lahko vnesete gen in nato z njimi opravite oploditev. Tako so bili vbrizgani geni za človeški interferon in inzulin, kunčji gen za β-globin, gen za timidin kinazo virusa herpes simpleks in cDNA virusa mišje levkemije. Število molekul, ki jih dajemo na injekcijo, je od 100 do 300.000, njihova velikost pa je od 5 do 50 kb. Običajno preživi 10 - 30 % jajčec, delež miši, skotenih iz transformiranih jajčec, pa se giblje od nekaj do 40 %. Dejanska učinkovitost je torej približno 10%.

Integracija tujih genov je nespecifična glede na kromosome, število kopij tujega gena pa lahko variira od nekaj do 100 ali več. Ti geni tvorijo skupino tandemskih ponovitev, združenih na način od glave do repa. Tujo DNK po injiciranju so našli v somatskih in zarodnih celicah. To pomeni, da pride do integracije v najzgodnejših fazah razvoja zigote.

V več primerih je bila heterologna DNK podedovana v treh generacijah miši, kar kaže na stabilno integracijo. DNK, integrirana v zarodne celice, se prenaša kot Mendelov gen. Ugotovljeno je bilo, da je stopnja izražanja tujega gena odvisna od mesta integracije DNA s kromosomi in od stopnje njegove metilacije ter od diferenciacije tkiv. V nekaterih primerih je bilo mogoče doseči tkivno specifično izražanje. Pomembno je omeniti, da se specifični tuji geni lahko vstavijo v celični genom na tak način, da ubogajo normalne regulativne signale.

Leta 1981 sta Constantini in Lacy (Oxford) v mišja jajčeca vbrizgala 19 kilobaznih fragmentov kromosomske DNK zajca. Ti fragmenti so vsebovali zajčji gen za β-globin. Jajčeca so gojili do stopnje blastociste in vsadili v maternico. Štiriindvajset miši, rojenih iz razvoja implantiranih jajčec, je bilo podvrženih delni hepatektomiji. Analiza DNK iz jetrnih celic je pokazala, da je bilo pri 9 miših od 1 do 20 kopij gena β-globina na celico. Po parjenju 4 transformiranih samcev z normalnimi samicami smo dobili potomce 18 živali. 6 jih je imelo tudi gen za β-globin. Ugotovljeno je bilo, da se genska integracija v celicah sesalcev pojavi naključno in ni povezana s specifičnimi regijami kromosoma. Gen je nestabilen in se lahko izgubi ali postane neaktiven. Regulacijske sekvence je treba uvesti skupaj z genom.

Metoda vnosa genov v embrionalne celice ima omejitve. Tuje DNK ni vedno mogoče vključiti v določeno regijo kromosoma. Razviti metodološki principi še ne omogočajo zamenjave obstoječega gena v genomu z izpodrivanjem, novega gena ni vedno mogoče podrediti regulacijskemu sistemu telesa.

Med transgenozo se lahko pojavijo nepričakovane težave. Na primer, nekaj prvih del na področju genetske transformacije živali je bilo opravljeno z vstavljanjem genov rastnega hormona. Prenos gena podganjega rastnega hormona na miši je povečal rast miši za 2-krat. Uspešni so bili tudi poskusi transgenoze genov govejega rastnega hormona v kunce. Toda podobni poskusi na spreminjanju veliki govedo privedlo do povečanja rasti le za 10-20 %. Očitno je to posledica dejstva, da miši ohranijo široko reakcijsko normo, in vstavljanje genov, ki povečajo količino hormona, prisili, da se genotip čim bolj uresniči. Pri živini zaradi usmerjene selekcije organizmi delujejo na zgornji meji reakcijske norme, zato se pričakovani učinek ni izkazal.

Pri nas so bili pridobljeni prašiči nosilci gena za somatotropin. V stopnjah rasti se niso razlikovale od normalnih živali, vendar je sprememba metabolizma vplivala na vsebnost maščob. Pri takšnih živalih so bili procesi lipogeneze inhibirani in aktivirana sinteza beljakovin. Vstavljanje genov insulinu podobnega faktorja je povzročilo tudi spremembe v metabolizmu. Takšni transgeni prašiči so bili ustvarjeni za preučevanje verige biokemičnih transformacij hormona, stranski učinek pa je bila krepitev imunskega sistema.

Najmočnejši sistem za sintezo beljakovin se nahaja v celicah mlečne žleze. Če postavite gene tujih proteinov pod nadzor kazeinskega promotorja, bo izražanje teh genov močno in stabilno, beljakovine pa se bodo kopičile v mleku (živalski fermentor). Proizvedene so že transgene krave, katerih mleko vsebuje človeško beljakovino laktoferin. Ta protein naj bi se uporabljal za preprečevanje gastroenteroloških bolezni pri ljudeh z nizko imunsko odpornostjo. To so bolniki z aidsom, nedonošenčki, bolniki z rakom, ki so bili podvrženi radioterapiji. Klinična preskušanja tega mleka so v teku. Genzyme Transgenics že načrtuje raziskave za ustvarjanje transgenega goveda, ki bi vsebovalo človeški albumin v mleku. Odkupljen je bil patent za pridobivanje zarodkov, ki vsebujejo genom celic vezivnega tkiva (fibroblastov), vključno z genom, odgovornim za sintezo človeških beljakovin. Ta tehnologija omogoča povečanje učinkovitosti ustvarjanja transgenih živali molznic, saj se z običajnim vbrizgavanjem genov v oplojeno jajčece skoti le 5-10% transformiranih živali, od tega je več samcev, ki ne proizvajajo mleka.

Uporaba nove tehnologije kloniranja omogoča pridobivanje samo samic živali, ki proizvajajo transgene beljakovine. Albumin se v terapiji uporablja za vzdrževanje osmotskega tlaka v krvi. Svet vsako leto potrebuje približno 440 tisoč litrov krvne plazme za izolacijo tega proteina (strošek približno 1,5 milijarde dolarjev). Vsaka krava molznica lahko letno proizvede 80 kg rekombinantnega humanega albumina. Genzyme Transgenics razvija podobne metode za proizvodnjo človeškega rastnega hormona in β-interferona.

V Angliji so ustvarili transgene ovce, katerih mleko vsebuje faktor strjevanja krvi.

Pri nas so bili poskusi ustvariti ovce, ki proizvajajo kimozin (encim za izdelavo sira). Dobili smo 2 ovci, pri eni gen ni bil izražen, pri drugi je vsebnost kimozina dosegla 300 mg/l. Vendar pa so potomci te ovce dali nizko mlečnost - približno 50 kg v obdobju laktacije. Razlog je bil v tem, da kimozin nastaja kot prekurzor - prohimozin, ki se pri pH = 5 pretvori v aktivni encim. Načrtovano je bilo prejemanje prohimozina, vendar je na nekaterih predelih vimena prišlo do znižanja pH, kar je povzročilo aktivacijo kimozina neposredno v telesu. Aktivni kimozin je sesiril mleko in zamašil kanale vimena. Zdaj poskušajo rešiti ta problem.

V moskovski regiji so pridobili kunce, ki izločajo γ-interferon in eritropoetin, vendar kunci niso tradicionalni proizvajalci mleka. Poskusi preobrazbe domačih živali so zelo dragi – ena transgena žival stane več deset in sto tisoč dolarjev.

Transgene živali se proizvajajo tudi za namene ksenotransplantacije. Eden najljubših darovalcev organov so prašiči, saj obstajajo anatomske podobnosti med organi in podobne imunološke lastnosti. Zavrnitvene reakcije med presaditvijo imajo zapleten mehanizem. Eden od signalov, da organizem napade tujek, so beljakovine, lokalizirane na zunanji površini membrane. Pri transgenih prašičih so te beljakovine nadomeščene s človeškimi.

Druga smer transgenoze je proizvodnja živali, odpornih na bolezni. Živinoreja sloni na cepivih, saj poteka selekcija predvsem na gospodarsko vredne lastnosti – volnatost, mlečnost itd. Povečevanje odpornosti je naloga genetskih inženirjev. Interferoni so zaščitne beljakovine, zato so gen za interferon vstavljali v različne živali. Transgene miši so bile odporne, niso zbolele ali pa so zbolele malo, pri prašičih pa takšnega učinka niso našli.

Druga smer je uvedba genov, ki kodirajo protismiselno RNK. Za živinorejo je levkemija, ki jo povzročajo virusi RNA, akuten problem. Transgeni kunci, ki so nosili gene, odgovorne za prisotnost protismiselne RNA v celici, so bili odporni na levkemijo.

Transgene živali se lahko uporabljajo za preučevanje dednih bolezni možganov in živčnega sistema. V genom normalnih živali so vneseni geni za Alzheimerjevo bolezen (odlaganje β-amiloidnega proteina povzroči nastanek značilnih plakov) in geni, odgovorni za nastanek epilepsije in možganskih bolezni; v tem primeru dobimo transgene živalske modele, na katerih lahko testiramo različne terapevtske tehnike.

Transgene živali so bile uporabljene za preučevanje človeških vnetnih in imunoloških bolezni, kot je revmatoidni artritis. Modelirane so bolezni, povezane s presnovo lipidov.

Zaključek

Čeprav genetika Genski inženiringže igrajo veliko vlogo v medicini in kmetijstvo, glavni rezultati šele prihajajo. Še vedno se moramo veliko naučiti o tem, kako kompleksni genetski sistemi delujejo v naših telesih in pri drugih vrstah.

Določiti je treba funkcije in namen posameznega gena, ugotoviti, kakšni so pogoji za njegovo aktivacijo, v katerih življenjskih obdobjih, v katerih delih telesa in v kakšnih okoliščinah se vklopi in vodi do sinteze ustrezne beljakovine. . Nato je treba razumeti, kakšno vlogo ima ta protein v telesu, ali presega celico, kakšna sporočila nosi, kakšne reakcije katalizira, kako vpliva na začetek. biološki procesi v drugih delih telesa, katere gene aktivira. Ločena težka naloga je reševanje problema zvijanja beljakovin - kako, če poznamo zaporedje aminokislin, ki sestavljajo beljakovino, določiti njeno prostorsko strukturo in funkcije. Ta problem zahteva nova teoretična znanja in zmogljivejše superračunalnike.

Toda znanstveniki niso prestrašeni zaradi obsega te naloge. Dekodiranje človeškega genoma je trajalo več kot deset let, reševanje problema zvijanja beljakovin bo morda trajalo nekoliko dlje, a ko bo rešen, bo človek lahko popolnoma nadzoroval življenjske procese v vseh organizmih na vseh ravneh.

Bibliografija

1. Alberts B., Bray D., Lewis J. et al. Molekularna biologija celic. T. 1 - 3. M.: Mir, 1994.

2. Analiza genoma. Metode / ur. K. Davis. M.: Mir, 1990. 246 str.

3. Atanasov A. Biotehnologija v rastlinski pridelavi. Novosibirsk: ICGSO RAS, 1993. – 241 str.

4. Baranovov V.S. Genska terapija– medicina XXI stoletja // Soros Educational Journal. št. 3. 1999. Str. 3 – 68.

5. Becker M.E., Liepins G.K., Raipulis E.P. Biotehnologija. M.: Agropromizdat, 1990. 334 str.

6. Borisyuk N.V. Molekularna genetska konstitucija somatskih hibridov // Biotehnologija. Rezultati znanosti in tehnologije VINITI AN ZSSR. M., 1988. T. 9. P. 73 -113.

7. Valikhanova G.Zh. Rastlinska biotehnologija. Almaty: Konzhyk, 1996. 272 str.

8. Gleba Yu.Yu. Rastlinska biotehnologija // Soros Educational Journal. št. 6. 1998. Str. 3 – 8.

9. Glebov O.K. Genetska transformacija somatskih celic // Metode gojenja celic. L.: Nauka, 1988.

10. Goldman I.L., Razin S.V., Ernst L.K., Kadulin S.G., Graščuk M.A. Molekularno biološki vidiki problema položajno neodvisne ekspresije tujih genov v celicah transgenih živali // Biotehnologija. 1994. št. 2.

11. Dyban A.P., Gorodetsky S.I. Vnos tujih genov v genom sesalcev: poti in možnosti // Molekularni in celični vidiki biotehnologije. L.: Nauka, 1986. str. 82 - 97.

12. Egorov N.S., Samuilov V.D. Sodobne metode za ustvarjanje industrijskih sevov mikroorganizmov // Biotehnologija. Knjiga 2. M .: Višja šola, 1988. 208 str.

13. Zvereva S.D., Romanov G.A. Reporterski geni za rastlinski genski inženiring: značilnosti in metode testiranja // Fiziologija rastlin. 2000. T. 47, št. 3. P. 479-488.

14. Leshchinskaya I.B. Genetski inženiring // Soros Educational Journal. 1996. št. 1. strani 33 - 39.

15. Li A., Tinland B. Integracija t-DNA v rastlinski genom: prototip in resničnost // Fiziologija rastlin. 2000, letnik 47, št. 3. Str. 354-359

16. Lutova L.A., Provorov N.A., Tihodejev O.N. in drugi. Genetika razvoja rastlin. Sankt Peterburg: Nauka, 200. 539 str.

17. Lewin B. Geni. M.: Mir, 1987. 544 str.

18. Piruzyan E.S., Andrianov V.M. Plazmidi agrobakterij in genski inženiring rastlin M.: Nauka, 1985. 280 str.

19. Piruzyan E.S. Genetski inženiring rastlin M.: Znanie, 1988. 64 str.

20. Piruzyan E.S. Osnove genskega inženiringa rastlin M.: Nauka, 1988. 304 str.

21. Piruzyan E.S. Problemi izražanja tujih genov v rastlinah // Rezultati znanosti in tehnologije VINITI. Ser. Biotehnologija. 1990. T. 23. 176 str.

22. Popov L.S., Yazykov A.A. Transgene živali kot modeli za preučevanje razmnoževanja embrionalni razvoj in človeške bolezni // Napredek sodobne biologije 1999. T 119, št. 1. Str. 30-41.

23. Romanov G.A. Genetski inženiring rastlin in načini reševanja problema biološke varnosti // Fiziologija rastlin, 2000. Letnik 47, št. 3. Str. 343-353

24. Kmetijska biotehnologija: Učbenik. / V.S. Shevelukha, E.A. Kalašnikova, S.V. Degtyarev et al.: Ed. V.S. Shevelukhi. M.: Višje. šola, 1998. 416 str.

25. Singer M., Berg P. Geni in genomi. T. 1-2. M.: Mir, 1998.

26. Tomilin N.V., Glebov O.K. Genetska transformacija celic sesalcev // Molekularni in celični vidiki biotehnologije. L.: Nauka, 1986. str. 62 - 82.

27. Favorova O.O. Genetsko zdravljenje – fikcija ali resničnost? // Soros izobraževalna revija. št. 2. 1997. str. 21 – 27.

28. Ščelkunov S.N. Genski inženiring. Del 1. Novosibirsk: Novosibirska univerzitetna založba, 1994. 304 str.

domov » Varnost otrok v prometu » Metode vnosa rekombinantne DNA v bakterijske celice. Nova metoda bistveno izboljša dostavo DNK v celice