Тромбоциты в камере горяева. Определение числа тромбоцитов в крови

Тромбоциты по Фонио – это наиболее распространенный и достоверный способ подсчета количества маленьких кровяных пластинок, которые образуются в костном мозге. Особенностью такого теста является то, что форменные элементы крови учитываются не в жидком виде, а в окрашенном мазке.

Такой анализ не имеет ограничений по половой принадлежности и возрастной категории, отчего является разрешенным для детей и представительниц женского пола в период беременности.

Для получения наиболее достоверной информации необходимо соблюдение нескольких несложных правил подготовки, о которых гематолог заранее предупреждает каждого больного.

Необходимость осуществления такого лабораторного теста заключается не только в том, чтобы выявить повышенное или пониженное содержание тромбоцитов в крови, но также для контроля над эффективностью терапии.

Преимущества метода

В настоящее время существует несколько методик подсчета уровня тромбоцитов: люминесцентная микроскопия, использование электронно-автоматических счетчиков, применение камеры Грязева. Однако в подавляющем большинстве случаев применяется именно метод по Фонио.

Положительные стороны такого исследования:

• высокая точность – достигается благодаря использованию специальной формы расчета, компоненты которой легко обнаруживаются в капле крови;
• быстрота осуществления – промежуток времени с момента забора биологического материала и до получения результатов составляет не более 2 часов, а с применением новейшего высокоточного оборудования вся процедура занимает не более получаса;
• отсутствие необходимости в дорогостоящих реактивах – для активации тромбоцитов достаточно введения коагулянтов, а также проводится подкрашивание мазка специальным раствором.

Именно такие факторы дают возможность получить более точную информацию, нежели при общеклиническом анализе крови или коагулограмме.

Кроме этого, подсчет тромбоцитов по Фонио обладает следующими особенностями:

• хорошая визуализация клеточных элементов;
• изучение биологического материала может быть проведено в любое время, а не сразу же после получения крови;
• вычисление уровня мелких кровяных пластинок облегчено их «привязкой» к 1000 эритроцитов на 1 миллилитр крови.

Однако подобная методика может иметь погрешности, которые связаны с плохим качеством мазка или неравномерным распределением тромбоцитов по специальному стеклу.

Факторы, влияющие на качество анализа

Специалисты из области гематологии, занимающиеся расшифровкой результатов, выделяют несколько основных факторов, которые могут очень сильно повлиять как на качество, так и на исход анализа.

Прежде всего, необходимо отметить, что существует специфическая подготовка к подобному лабораторному тесту:

• Кровь не берется у пациента, находящегося в состоянии алкогольного опьянения, поскольку на этом фоне норма тромбоцитов повышается в 3-4 раза.
• Исследование не осуществляется при сильной физической усталости человека, а также в случае длительного влияния стрессовых ситуаций. Такие расстройства могут вызвать чрезмерную выработку форменных элементов, что является исключительно временным явлением и не несет в себе никакой информации о реальном положении вещей.
• Анализ выполняют на голодный желудок.
• За неделю до посещения врача необходимо полностью отказаться от приема каких-либо медикаментов. Если по каким-либо причинам сделать это невозможно, то следует проинформировать об этом клинициста.

Оптимальным временем для взятия образца являются утренние часы, а именно: с 7 до 9 утра.

Второе условие, влияющее на результат – качество реактивов. При применении некачественных веществ будут получены ложноположительные отклонения от нормы. В таких ситуациях человеку необходимо сдавать тест трижды, с промежутком в 2-3 суток. Это даст возможность свести к минимуму любые погрешности.

Помимо этого, учитываются особые состояния организма, а именно:

• протекание менструации;
• период вынашивания ребенка;
• грудное вскармливание;

Именно такие обстоятельства приводят к тому, что результативность методики по Фонио значительно понижается.

Ход процедуры

Подсчет тромбоцитов по методу Фонио предусматривает окрашивание мазка крови специальным красителем. Подобные форменные элементы крови рассчитываются на 1000 эритроцитов, после чего переводятся в соотношение на 1 литр крови.

Реактивами, применяемыми во время такого теста, выступают:

• сульфат магния 14% раствор;
• краситель Романовского-Гимзы;
• фиксаторы Лейшмана и Май-Грюнвальда.

Перед тем как нанести то или иное вещество на кожный покров пациента, необходимо его предварительно обработать. Для забора крови из пальца делается небольшой прокол. При изучении не используется первая капля крови. После этого наносится небольшая капля раствора одного из вышеуказанных веществ и осторожно смешивается. Из получившегося соединения делают мазок для последующего изучения. Стоит отметить, что кровь высушивается и окрашивается по методу Паппенгейма.

Далее предметное стекло помещают под микроскоп и снижают количество красных кровяных телец до тысячи. Во внимание берутся только близлежащие клетки, формирующие между собой группы. Единичные включения не имеют никакой ценности при таком исследовании.

После получения необходимого уровня эритроцитов параметры тромбоцитов рассчитывают по следующей формуле – Х=АхВ, а полученное число делят на 1000, где:

• Х – это искомое количество тромбоцитов;
• А – число кровяных пластинок в мазке на тысячу эритроцитов;
• В – концентрация красных кровяных телец в литре крови;
• 1000 – показатель эритроцитов в исследуемом мазке.

Второй вариант действий лаборанта заключается в том, что в пробирку с капиллярной кровью вносят определенное количество магнезии или ЭДТА, тщательно перемешивают и готовят мазок. Затем смесь высушивается и окрашивается одним из вышеуказанных красителей. Формула расчета остается неизменной.

Именно такими способами определяется норма тромбоцитов как у взрослого человека, так и у ребенка.

Показатели нормы и отклонения от нее

Тромбоциты по Фонио норма будет немного отличаться в зависимости от влияния нескольких факторов, а именно: половой принадлежности и возрастной категории человека.

Установленный допустимый уровень описываемого компонента крови на 1 куб. миллиметр крови варьируется от 120 до 400 тысяч.

Варианты нормы:

Как повышенные, так и пониженные значения укажут специалисту на то, что в организме человека протекает тот или иной патологический процесс.

Если тромбоциты по Фонио снижены, то это в подавляющем большинстве случаев указывает на наличие следующих патологий:

• лучевая болезнь;
• острое отравление химическими веществами или ядами;
• коллагеноз;
• патологии кроветворной системы;
• злокачественные новообразования любой локализации;
• малокровие;
• поражение печени;
• различные аллергические реакции;
• обильные кровопотери;
• инфекционные недуги;
• передозировка медикаментами;
• хронический алкоголизм.

Когда анализ показал возрастание подобного элемента, то наиболее часто это указывает на:

Для установления окончательного результата потребуются дополнительные лабораторные тесты, инструментальные процедуры и консультации клиницистов из различных областей медицины.

Повышенные и пониженные тромбоциты по Фонио требуют коррекции, что основывается на ликвидации базового заболевания или предрасполагающего фактора, не имеющего отношения к протеканию какого-либо недуга, например, алкоголизм или передозировка медикаментами.

Для восстановления нормального уровня необходимо:

• принимать лекарственные препараты с обязательным контролем суточной нормы и длительности приема;
• использовать рецепты народной медицины – показано только после одобрения лечащего врача;
• соблюдать определенные правила питания;
• полностью отказаться от вредных привычек.

В любом случае терапия будет носить индивидуальный подход. Однако полный отказ от квалифицированной помощи влечет за собой развитие осложнений, которые иногда несут угрозу для жизни человека.

Определение числа тромбоцитов - важнейший метод исследования, способный обнаружить наиболее частое нарушение гемостатического потенциала крови - тромбоцитопению. В настоящее время для определения числа тромбоцитов имеется несколько лабораторных технологий (автоматизированный, по Фонио и др.). Наибольшую точность имеет микроскопический метод при подсчете в камере, однако этот метод требует от врача-лаборанта опыта, напряжения зрения, концентрации внимания.

Принцип метода

Принцип метода основан на определении числа тромбоцитов путем их подсчета в камере Горяева обычной световой микроскопией или с помощью микроскопа с фазово-контрастной приставкой после разведения крови и гемолиза эритроцитов раствором оксалата аммония.

С целью повысить точность микроскопического метода число тромбоцитов подсчитывают в двух камерах, затем вычисляют среднюю арифметическую.

Реактивы и оборудование

• 1% раствор оксалата аммония.
• Смеситель Сали.
• Камера Горяева (2 шт.).
• Световой микроскоп с увеличением х 40 или микроскоп с фазово-контрастной приставкой (например, КФ-4 или др.).

Образцы крови для исследования

Определение числа тромбоцитов возможно в крови, стабилизированной цитратом натрия или нанесенным на стенки пластиковой пробирки мелкодисперсным порошком этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). При использовании микроскопического метода предпочтительнее брать кровь на цитрате натрия, чтобы исключить влияние ЭДТА на результаты подсчета тромбоцитов.

Техника выполнения

В сухую пластиковую пробирку вносят 1,98 мл 1% оксалата аммония и 0,02 мл крови. Медленно и аккуратно перемешивают смесь в течение 2 мин, а затем ее инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре. Далее заполняют две камеры Горяева содержимым пробирки и на 10 мин помещают их в чашку Петри, в которой находится влажная марля или смоченный фильтр. После этой инкубации, которая необходима для оседания тромбоцитов, подсчитывают их число в 25 квадратах. Среднюю арифметическую результатов подсчета в двух камерах умножают на 1000. При исследовании цитратной крови результат увеличивают на 10 % и умножают на 1000, что позволяет корректировать разведение венозной крови раствором натрия цитрата.

Оценка результатов исследования

У здорового человека число тромбоцитов в периферической крови колеблется в довольно широком диапазоне - от 150 до 400 х 109/л.

Недопустимо исследование числа тромбоцитов в охлажденных образцах крови. При гемолизе возможно занижение числа тромбоцитов. В ряде случаев при исследовании числа тромбоцитов на гематологических анализаторах встречается так называемая псевдотромбоцитопения, обусловленная агрегацией и группировкой тромбоцитов в присутствии ЭДТА. Эту проблему решает забор крови на цитрате натрия.

Для обеспечения контроля качества при подсчете числа тромбоцитов на гематологических анализаторах существуют контрольные образцы с разным содержанием этих клеток. О возможности использования этих образцов для обеспечения контроля качества при подсчете числа тромбоцитов микроскопическим методом не существует общепринятых рекомендаций. Для повышения точности результатов микроскопического исследования следует периодически контролировать воспроизводимость результатов определения числа тромбоцитов разными лаборантами в течение рабочего дня и на основе полученных данных повышать точность и снижать вариацию при выполнении этой методики Коэффициент вариации микроскопического метода у опытных лаборантов не превышает 10 %.

Интерпретация результатов исследования

В клинической картине тяжелого течения идиопатической тромбоцитопенической пурпуры доминирует геморрагический синдром. При вторичных тромбоцитопениях геморрагический синдром, как правило, умеренный, и сочетается с клиническими симптомами основного заболевания, обусловившими тромбоцитопению. В тех случаях, когда число тромбоцитов менее 100 х 109/л длительно наблюдается без каких-либо проявлений фонового заболевания, следует думать об идиопатической тромбоцитопенической пурпуре.

Тромбоцитозы также наблюдаются при миелопролиферативных заболеваниях. Нередко на фоне миелопролиферации отмечают нарушения реологических свойств крови за счет полиглобулии. В последнем случае, а также при числе тромбоцитов более 700 х 109/л у пациентов повышается риск тромбозов. Однако на фоне миелопролиферативных заболеваний, сопровождающихся тромбоцитозом более 1500 х 109/л, парадоксально наблюдается геморрагический синдром.

При тромбоцитопении и наличии геморрагического анамнеза с раннего детского возраста весьма важно оценить размер тромбоцитов, в т. ч. MPV (средний объем) в мазке крови, а также наличие каких-либо включений в тромбоциты.

Причины ошибок

• Использование одной камеры, меньшее число подсчитываемых квадратов.
• Неточность градуировки разных смесителей.
• Ошибки преаналитического этапа исследования, в т. ч. неправильная дозировка цитрата при заборе венозной крови.
• Недостаточная квалификация лаборанта.

Другие аналитические технологии

Практически все гематологические анализаторы неплохо измеряют число эритроцитов и лейкоцитов в крови, хорошие результаты точности и воспроизводимости демонстрирует метод определения концентрации гемоглобина, реализованный в таких приборах. Однако и в настоящее время еще встречаются образцы анализаторов, которые число тромбоцитов при тромбоцитопениях подсчитывают неточно, и, как правило, наблюдается завышение числа тромбоцитов при их автоматизированном подсчете. Особенно ярко этот недостаток проявляется при работе с образцами крови, в которых число тромбоцитов ниже 50 х 109/л. Этот недостаток есть следствие того, что тромбоциты гораздо мельче других клеток крови, поэтому сложнее выполнить их корректный подсчет в той же камере и такими же техническими приемами, что и другие клетки крови. Следует отметить также, что на показатели точности подсчета тромбоцитов на гематологическом анализаторе весьма существенное влияние оказывают качество и надежность используемых калибраторов. Именно поэтому в сложных диагностических ситуациях или при глубокой тромбоцитопении в анамнезе для уточнения числа тромбоцитов следует применять микроскопический метод.

Подсчет клеток крови в окрашенных мазках имеет низкую точность и воспроизводимость, поэтому он не может быть рекомендован для применения в современных клиниках.

Норма у здорового человека:

Исследование по методике Фонио применяется наиболее часто. Оно базируется на определении количества пластинок в окрашенных мазках крови с использованием химреактивов:

• сульфат магния 14%;
• этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) натрия 6%.

Подсчет тромбоцитов в мазке крови

Ход исследования

Сульфат магния или ЭДТА при помощи капилляра Панченкова помещают в стеклянную пробирку, туда же помещают капиллярную кровь, которую берут, используя тот же капилляр.

Кровь с реактивом перемешивают, а затем из полученного раствора готовят материал для определения.

Для этого на предметное стекло наносятся тонкие мазки, они фиксируются и окрашиваются:

• с применением магния сульфата – 2-3 часа;
• с использованием ЭДТА – 30-45 минут.

После высыхания мазки разглядывают под микроскопом, у которого имеется иммерсионный объектив для увеличения изображения и усиления яркости.

Кровяные пластинки должны располагаться по отдельности, чтобы этого добиться используется самое тонкое место мазка.

Как считать тромбоциты в мазке крови?

Для подсчета мазок передвигается под объективом микроскопа, чтобы были подсчитаны 1000 эритроцитов. Затем считают находящиеся среди них кровяные пластинки.

При известном количестве эритроцитов в одном литре крови, можно произвести подсчет абсолютного числа тромбоцитов.

Определение количества при помощи камеры Горяева

По методу Горяева тромбоцитарные пластинки считает камера с применением цитратного вещества. Число клеток определяют в 1 МК/л или в литре крови.

Для этого используют следующие химреактивы:

Химреактив №1:

• гидрохлорид кокаина 3 г;
• хлорид натрия 0,25 г;
• фурацилин 0,25 г;
• вода 100 мл.

Химреактив №2:

• 1% раствор оксалата аммония. Раствор надо прокипятить, профильтровать и после этого он хранится на холоде. При помощи этого реактива растворение эритроцитов происходит быстрее.

Ход исследования

Используют материал, взятый из вены в пробирку с цитратом. Этим веществом служит ЭДТА. При взятии из пальца тромбоциты могут давать сгустки.

Нужно взять 4 мл химреактива №1 или №2, добавить 0,02 мл крови, получится разведение в 200 раз. Кровь с реактивом слегка взбалтывают, оставляют на полчаса, за это время происходит лизис.

В подготовленную камеру помещают материал из подготовленной крови, а затем опускают во влажную чашку Петри на 5 минут для оседания тромбоцитарных клеток.

В камере клетки хорошо видны, благодаря тому, что используется фазово-контрастные линзы объектива.

Частицы пыли и грязи должны быть хорошо вымыты, чтобы не оставлять след на стеклянной таре и самой камере, иначе их при подсчете можно принять за тромбоциты.

Подсчитывание с помощью счетчиков

Счетчик называется автоматический гематологический аппарат. С его помощью можно определить количество кровяных пластинок, также сделать гистограмму (распространение по величине).

Аппаратное исследование достаточно точное, делается экспресс-методом, который выдает результаты в течение 1 минуты.

Тромбоциты – уникальные безъядерные клетки, которые не только принимают активное участие в регенерации клеточных структур, а также препятствуют развитию обильного кровотечения, но и регулируют процессы проницаемости клеточных мембран. Их количество в крови может свидетельствовать о состоянии здоровья, а отклонения от нормы – первая причина развития патологических процессов сердечно-сосудистой системы. Данные клетки синтезируются из плазмы мегакариоцитов – крупных клеток костного мозга. Продолжительность жизни не велика – всего 5-7 дней, после чего они утилизируются селезенкой и частично печенью. Тромбоцитам свойственно старение, от которого зависит качественный состав крови. Чтобы определить уровень содержания тромбоцитов в крови, используют лабораторный анализ Фонио, при котором исчисление производится наиболее точно . Особенности этого метода и способы вычислений разберем далее.

Такой способ лабораторного исследования предполагает забор крови из пальца, после чего ее смешивают с реактивами и рассматривают мазок под микроскопом . Определение числа тромбоцитов исчисляется по формуле, в эквиваленте отношения к эритроцитам, как наиболее тяжелым и объемным кровяным клеткам. То есть, каждый мазок рассматривают в перерасчете на 1000 эритроцитов. Такое соотношение позволяет более точно выявить наличие патологий синтеза тромбоцитарных клеток, а также снижает риски выявления псевдобтромбоцитоза.

Если рассматривать это соотношение более подробно, то вначале исчисляется общее количество эритроцитов в мазке, после чего показатель умножается на мл или мкл крови . Полученную величину сопоставляют с количественным составом тромбоцитов.

Суть метода основывается на взаимозависимости фракций крови. Иными словами, при повышенном содержании тромбоцитов, эритроцитов также будет больше. Прямая пропорциональность позволяет определять не только тромбоцитарный уровень в мазке крови, но и пересчитывать его на литры и микролитры.