Законодательная база российской федерации. Гельминтологические методы исследования

Глава III. Диагностика гельминтозов и методы гельминтологических исследований

Необходимо обследовать на гельминтозы всех больных, обращающихся за медицинской помощью, и особенно больных, обращающихся к педиатру, терапевту и невропатологу с жалобами на явления со стороны желудочно-кишечного тракта, нервной системы и с анемией. Если врач не всегда может применить лабораторные методы исследования, то опросить больного о выделении у него гельминтов обязан каждый медицинский работник, оказывающий помощь в амбулатории или стационаре.

При наличии приведенных в соответствующих главах клинических показаний следует уточнить диагноз при помощи лабораторных методов исследования на гельминтозы.

В связи с преобладанием кишечных гельминтозов наибольшее практическое значение имеет исследование испражнений.

Методы исследования испражнений на гельминтозы

Испражнения доставляются в лабораторию в чистой стеклянной посуде (около четверти стакана испражнений, взятых из разных мест одной порции); при плановом обследовании допускается доставка испражнений в лабораторию в спичечных или лубочных коробочках.

Для контроля дегельминтизации доставляется (по назначению врача) вся порция испражнений, собранная после приема противоглистного средства и слабительного (в больших закрытых стеклянных банках, ведрах).

Микроскопическое исследование испражнений является основным при диагностике кишечных гельминтозов; ему всегда должен предшествовать общий макроскопический осмотр фекалий для обнаружения члеников крупных цестод, остриц, аскарид и др.

Испражнения должны быть свежими или консервированными (в 5% растворе формалина), так как высыхание резко изменяет структуру яиц. Кроме того, при стоянии фекалий происходит быстрое развитие яиц некоторых гельминтов (например, анкилостом), что затрудняет диагностику.

Согласно инструкции Министерства здравоохранения СССР, необходимо исследовать испражнения одновременно по методу Фюллеборна и нативного мазка.

Нативный мазок

Нативный мазок: небольшой кусочек фекалий (с горошину), взятый спичкой, стеклянной или деревянной палочкой из разных мест доставленной порции, тщательно растирают на предметном стекле в капле 50% раствора глицерина или в физиологическом растворе, или в воде. Накрывают покровным стеклом, слегка надавливая последнее (препаровальной иглой). Мазок должен быть тонким, прозрачным и равномерным. Он применяется лишь как дополнение к другим методам, дающим обогащение препарата. Просматривать следует не менее двух препаратов.

С целью обнаружения личинок гельминтов (а также яиц их) нативный мазок делается следующим образом (по Шульману): 2-3 г фекалий тщательно размешивают «закручиванием» стеклянной палочкой в эмульсию с пятикратным количеством чистой воды или физиологического раствора. Во время размешивания личинки скопляются у стеклянной палочки, поэтому тотчас после окончания размешивания каплю эмульсии быстро переносят стеклянной палочкой на предметное стекло, накрывают покровным и исследуют. С. Д. Любченко (1936) доказала, что метод закручивания является более эффективным, чем метод мазка, особенно в отношении яиц аскарид. На основании работы С. Д. Любченко мы считаем целесообразным заменить метод мазка методом закручивания.

Метод Фюллеборна

Метод Фюллеборна: 5-10 г фекалий, взятых из разных мест, помещают в баночку емкостью в 50-100 мл и тщательно растирают стеклянной или деревянной палочкой в насыщенном растворе поваренной соли (400 г этой соли растворяют в 1 л воды, нагревают до кипения и фильтруют через слой ваты или марли; раствор употребляется холодный: удельный вес 1,2). Раствор приливают постепенно, пока не получится равномерная суспензия, причем общее количество приливаемого раствора должно быть приблизительно в 20 раз больше количества фекалий. Для перемешивания фекалий Фюллеборн рекомендовал употреблять чайные стаканы, но удобнее готовить суспензию в баночках для мази емкостью в 50-100 мл, используя по две баночки на каждый анализ (или в стаканчиках емкостью в 100 мл).

Тотчас после приготовления суспензии с поверхности ее удаляют шпателем, металлическим совочком или кусочком чистой бумаги всплывшие на поверхность крупные частицы (растительные образования, непереваренные остатки пищи и пр), после чего смесь оставляют стоять на 1-1,5 часа. По истечении этого времени с поверхности смеси снимают всю пленку прикосновением проволочной или платиновой петли (плашмя) диаметром не больше 1 см, согнутой под прямым углом; пленку стряхивают на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. Под каждое покровное стекло (18х18 мм) помещают 3-4 капли. Всего следует приготовить не менее 4 препаратов (на каждый препарат - одно покровное стекло). Петлю прокаливают на огне и промывают водой после каждого анализа.

По методу Фюллеборна быстро и легко обнаруживаются яйца всех нематод (за исключением неоплодотворенных яиц аскарид) и яйца карликового цепня.

Метод Бермана применяется для исследования испражнений на личинки гельминтов (при стронгилоидозе). Этот метод заключается в следующем: 5 г фекалий на металлической сетке (для этих целей удобна цедилка для молока) помещают на стеклянную воронку, прикрепленную к штативу. На нижний конец воронки надевают резиновую трубку с зажимом.

Сетку с калом приподнимают и в воронку наливают нагретую приблизительно до 50° воду таким образом, чтобы нижняя часть сетки с калом была погружена в воду. Личинки активно переходят в воду и скопляются в нижней части резиновой трубки. Через 2-4 часа открывают зажим и жидкость спускают в одну или две центрифужные пробирки.

После центрифугирования в течение 1-2 минут верхнюю часть жидкости быстро сливают, а осадок наносят каплями на предметные стекла и исследуют под покровными стеклами или распределяют тонким слоем на 2-3 больших стекла и тогда исследуют без покровных стекол.

Метод Бермана применяется также и для исследования почвы на наличие личинок анкилостом.

Метод Столла

Метод Столла применяется для определения интенсивности инвазии. В специальную стеклянную колбочку наливают децинормальный раствор едкого натра до метки 56 см 3 , а затем прибавляют испражнения до тех на пор, пока уровень жидкости не достигнет 60 см 3 , т. е. 4 см 3 . После взбалтывания со стеклянными бусами берут для исследования 0,075 мл смеси и исследуют под одним-двумя обычными покровными стеклами. Полученную сумму умножают на 200, чтобы получить количество яиц, содержащихся в 1 см 3 испражнений.

Исследование дуоденального содержимого

Дуоденальный сок и пузырную желчь, полученные обычным путем при помощи зондирования (а пузырную желчь и после рефлекса с желчного пузыря), тщательно смешивают с равным объемом этилового эфира; смесь центрифугируют, после чего осадок исследуют под микроскопом. Помимо осадка, микроскопическому исследованию обязательно подвергаются плавающие в жидкости хлопья, в которых могут находиться яйца гельминтов. При исследование на яйца гельминтов желудочного сока и рвотных масс можно пользоваться этой же методикой.

Исследование дуоденального сока и содержимого желудка необходимо производить при подозрении на глистные заболевания печени, желчного пузыря (описторхоз, фасциолез, дикроцелиоз) и двенадцатиперстной кишки (стронгилоидоз).

Исследование мокроты

Мокроту растирают по стеклянной пластинке, плотно накрывают другой стеклянной пластинкой и рассматривают невооруженным глазом на светлом и черном фоне, а также под лупой при проходящем свете. Отдельные кусочки мокроты («ржавые» скопления, обрывки тканей и пр.) наносят тонким слоем на предметное стекло, плотно накрывают его покровным и исследуют при малом и большом увеличении микроскопа.

а) Для диагносцирования цистицеркоза кожи, подкожной клетчатки или мышц, асептически вырезанный кусочек соответствующей ткани исследуют сначала не вооруженным глазом. Участки тканей раздвигают при помощи препаровальных игл с целью обнаружения видимого простым глазом пузырька - цистицерка (фото А); длина его 6-20 мм, ширина 5-10 мм. При обнаружении пузырька, подозрительного на цистицерк, он раздавливается между двумя предметными стеклами и рассматривается под микроскопом. Цистицерк (Cistycercus cellulosae) определяется по наличию сколекса с четырьмя присосками и венчиком крючьев (фото Б).

Фото. А — цистицерки с вывернутыми наружу сколексами; Б — Головка свинного цепня.

б) Для диагносцирования трихинеллеза асептически вырезанный кусочек мышцы (двуглавой или икроножной) тщательно измельчают в 50% растворе глицерина на тончайшие волоконца с помощью препаровальных игл. Измельченные мышцы сдавливаются между двумя предметными стеклами и исследуются при малом увеличении микроскопа в затемненном поле зрения. Исследование мышц на трихинеллез рекомендуется производить не ранее чем на 8-й день заболевания. Личинки трихинелл находятся в мышцах в свернутом спиралью положении: они заключены в лимонообразные капсулы.

Фото. А —Личинки трихинелл в мышцах; Б — Обызвествленные капсулы трихинелл.

Рентгеноскопия

Наиболее часто рентгеноскопия применяется для диагносцирования эхинококкоза и реже - цистицеркоза. Цистицерки обнаруживаются при рентгеноскопии только после обызвествления (в случаях длительного заболевания). За последние годы рентгеноскопия применяется и для диагносцирования аскаридоза как в ранней личиночной стадии, так отчасти и в кишечной стадии.

В период миграции личинок аскарид (и анкилостомид) в легких выявляются нестойкие, иногда множественные воспалительные очаги; одновременно в крови появляется значительная эозинофилия.

Половозрелые аскариды хорошо видны при рентгеноскопии кишечника пораженных лиц. Этот метод, несмотря на его сложность и громоздкость, должен быть использован как дополнительный для диагностики аскаридоза в случаях с отрицательным копрологическим анализом. По данным Е. С. Геселевич, из 180 больных аскаридозом, выявленных при рентгеноскопии, у 54 в кале не было обнаружено яиц аскарид (смотри ).

Методы гельминтологических исследований делятся на прямые и косвенные. Прямые методы: выявление самих гельминтов, их фрагментов, яиц, личинок в фекалиях, моче, дуоденальном секрете, мокроте, носовой и влагалищной слизи, содержимом подногтевых пространств, биопсированных кусочках ткани. Косвенные методы: выявление вторичных изменений, возникающих в организме человека в результате жизнедеятельности паразита, серологическими реакциями, общим исследованием крови, мочи. Наиболее распространенными методами исследования фекалий являются гельминтоовоскопические и протозооскопические. При диагностике нельзя каким-либо одним методом выявить яйца или личинки всех видов гельминтов, обитающих в пищеварительной системе человека. Так, при использовании метода флотации в поверхностную пленку не всплывают (из-за высокого удельного веса) яйца трематод, в некоторых случаях неоплодотворенные яйца аскарид. В кале очень редко можно обнаружить яйца остриц, онкосферы тениид, которые выявляются специальными методами исследований: соскоб с перианальных складок для остриц и тениид, методы осаждения для трематод (яйца описторха и др.). Поэтому для целенаправленного обследования больного на гельминтозы врач в направлении должен указать, на какие гельминты следует обратить основное внимание (диагноз), что позволит лаборанту выбрать соответствующую методику для выявления данного вида гельминта. Фекалии, взятые из разных мест испражнений в количестве не менее 50 граммов (чайная ложка) в чистую стеклянную посуду, должны быть отправлены в лабораторию не позднее чем через сутки после дефекации и исследованы в день поступления. В случае необходимости сохранения кала до следующего дня его помещают в холодное место (0-4°С) или заливают одним из консервантов. Перед исследованием кал перемешивают палочкой, чтобы яйца гельминтов оказались равномерно распределенными в общей массе. При обнаружении в препарате яиц какого-либо гельминта просмотр не прекращают, т.к. может быть двойная или тройная инвазия. Контроль за эффективностью лечения гельминтозов осуществляется путем исследования фекалий на яйца гельминтов через 2-3 недели или через 2-3 месяца после лечения в зависимости от обнаруженного гельминта. Макроскопические методы служат для обнаружения в кале целых половозрелых гельминтов или их фрагментов невооруженным глазом или с помощью ручной лупы. Часто на поверхности кала после дефекации можно видеть активно ползающих остриц; выделяются с калом аскариды; иногда люди сами замечают отхождение гельминтов. У больных дифиллоботриозом могут выделяться обрывки стробилы лентеца (в виде "лапши"), а у инвазированных тениидами (свиной или бычий цепень) с калом часто отходят членики гельминтов (в виде "белых обсечек") или они активно выползают из анального отверстия. Макроскопический метод является основным для дифференциальной диагностики тениидоза и тениаринхоза (в сочетании с опросом). Из специальных макроскопических методов применяется метод последовательного промывания фекалий. Фекалии размешиваются в воде для получения равномерной суспензии, после чего при хорошем освещении их тщательно просматривают отдельными небольшими порциями в черных фотографических кюветах или на темном фоне в чашках Петри. Пинцетом или препаровальной иглой извлекают все подозрительные белые частицы, крупные образования, подозрительные на фрагменты гельминтов, и рассматривают их под лупой между двумя предметными стеклами. Мелких гельминтов или головки цестод рассматривают под лупой в капле глицерина или под микроскопом. При использовании этого метода для диагностики члеников свиного, бычьего цепней, широкого лентеца отмытые членики помещают между двумя стеклами и, просматривая на свет под лупой или малым увеличением микроскопа, определяют видовую принадлежность по строению матки (у зрелого членика свиного цепня от центрального ствола отходят 8-12 боковых ответвлений, а у бычьего цепня 18-32, чаще 28-32, у широкого лентеца членики больше в ширину и матка в центре в виде "розетки"). Если матку плохо видно, то ее предварительно можно подержать некоторое время в 50% растворе глицерина, после чего даже запустевшие стволы матки просматриваются хорошо. При определении этих цестод по строению отошедших головок их с шейкой осторожно кладут в каплю глицерина между предметными стеклами (или покрывают покровным стеклом) и, не передавливая, рассматривают под микроскопом при малом увеличении.

Микроскопические методы подразделяются на простые, сложные и специальные.

К простым относятся методы нативного мазка, нативный мазок раствором Люголя, методы толстого мазка под целлофаном по Като, закручивания (по Шульману) и перианального соскоба.

Сложные методы являются более эффективными и основаны на концентрации яиц в препаратах. Они включают в себя предварительную обработку фекалий жидкими реактивами, в результате чего яйца гельминтов или выпадают в осадок, или всплывают на поверхность жидкости.

К сложным методам относятся методы обогащения:

а) флотационные (когда удельный вес яиц меньше удельного веса солевого раствора и яйца всплывают в поверхностную пленку);

б) седиментационные (когда удльный вес яиц больше удельного веса солевых растворов и яйца оседают в осадок).

Специальными методами обнаружения яиц и личинок гельминтов, цист и вегетативных форм простейших являются методы соскоба, флотации, седиментации, ларвоскопии, протозооскопии, исследование желчи и методы окраски мазков кала, мокроты и др.

При обнаружении яиц гельминтов на различных объектах окру­жающей среды (почва, вода, овощи и др.) всегда необходимо опре­делять их жизнеспособность по внешнему виду, окрашиванием ви­тальными красками, культивированием в оптимальных условиях и постановкой биологической пробы, т.е.

Скармливанием лаборатор­ным животным.

Определение жизнеспособности яиц или личинок гельминтов по внешнему виду. Яйца гельминтов микроскопируют вначале при ма­лом, затем при большом увеличении. У деформированных и мерт­вых яиц гельминтов оболочка разорвана или прогнута внутрь, плаз­ма мутная, разрыхлена. У сегментированных яиц шары дробления (бластомеры) неравного размера, неправильной формы, часто сдви­нуты к одному полюсу. Иногда встречаются аномальные яйца, ко­торые, имея внешние уродства, развиваются нормально. У живых личинок аскарид мелкая зернистость имеется только в средней час­ти тела, по мере их гибели зернистость распространяется по всему телу, появляются крупные блестящие гиалиновые вакуоли - так называемые нитки жемчуга.

Для определения жизнеспособности зрелых яиц аскарид, власо­главов, остриц следует вызывать активные движения личинок лег­ким подогреванием препарата (до температуры не выше 37 °С). Жиз­неспособность личинок аскарид и власоглавов удобнее наблюдать после их выделения из скорлупы яйца надавливанием на покровное стекло препарата препаровальной иглой или пинцетом.

У инвазионных личинок аскарид часто замечается чехлик, отсло­ившийся на головном конце, а у закончивших развитие в яйце ли­чинок власоглавов на этом месте при большом увеличении обнару­живается стилет. У погибших личинок гельминтов независимо от места их нахождения (в яйце или вне его) замечают распад тела. При этом внутренняя структура личинки становится глыбчатой или зер­нистой, а тело мутным и непрозрачным. В теле обнаруживаются ва­куоли, а на кутикуле - разрывы.

Жизнеспособность онкосфер тениид (бычьего, свиного цепней и др.) определяют по движению зародышей при воздействии на них пищеварительных ферментов. Яйца помещают на часовое стекло с желудочным соком собаки или искусственным дуоденальным соком. Состав последнего: панкреатина 0,5 г, натрия бикарбоната 0,09 г, дистиллированной воды 5 мл. Часовые стекла с яйцами ставят в термостат при 36-38 “С на 4 ч. При этом живые зародыши осво­бождаются от оболочек. Оболочки живых онкосфер также раство­ряются в подкисленном пепсине и в щелочном растворе трипсина через 6-8 ч в термостате при 38 °С.

Если поместить яйца тениид в 1 % раствор натрия сульфида, или 20 % раствор натрия гипохлорида, или же в 1 % раствор хлорной воды при 36-38 °С, зрелые и живые зародыши освобождаются от оболочек и не изменяются в течение 1 сут. Незрелые и мертвые он­косферы сморщиваются или набухают и резко увеличиваются, а затем «растворяются» в течение 10 мин - 2 ч. Живые зародыши тениид также активно двигаются в смеси 1 % раствора натрия хлорида, 0,5 % раствора натрия гидрокарбоната и желчи при 36- 38 °С.

Жизнеспособность сколексов эхинококков определяют при сла­бом нагревании. Для этого отмытые в воде сколексы или выводко­вые капсулы помещают в каплю воды на предметное стекло с лу­ночкой, покрывают покровным стеклом и исследуют под микроско­пом с нагревательным столиком при температуре 38-39 °С. Если отсутствует нагревательный столик, препарат подогревают при помощи любого источника тепла. При этом жизнеспособные ско­лексы активно двигаются, сокращая или расслабляя присоски, уд­линяя и укорачивая хоботок. Если поместить сколексы в 0,5-1 % водный раствор филицилена при комнатной температуре, то все жизнеспособные сколексы быстро вывернутся и погибнут. Нежиз­неспособные сколексы при этом не вывертываются.

Жизнеспособность адолескариев фасциол, собранных на расте­ниях и других объектах водоемов, проверяют исследованием их на предметном стекле в физиологическом растворе под микроскопом с нагревательным столиком. При подогревании личинки тремато­ды, находящиеся в цисте, начинают двигаться.

Жизнеспособность яиц карликового цепня определяют по распо­ложению крючьев на зародыше.

В живых яйцах карликового цепня происходят вялые маятнико­образные движения протоплазмы и почти незаметные раздвигания и сдвигания заостренных концов латеральной пары крючьев в сто­роны от средней пары.

Сокращения протоплазмы зародыша и зародышевых крючьев помогают зародышу освободиться сначала от оболочек онкосферы, а затем и от наружной оболочки яйца.

В живом яйце медианная пара и боковые пары крючьев распо­ложены параллельно, в некоторых яйцах лезвия боковых пар сбли­жены и расположены по отношению к средней паре крючьев под углом менее 45°.

Погибающий зародыш конвульсивно сокращается и вяло раздви­гает крючья. В погибшем зародыше движение крючьев прекраща­ется, и они располагаются в беспорядке, иногда же латеральные по отношению к соседней паре крючья бывают раздвинуты под пря­мым, тупым или острым углом.

Иногда наблюдаются сморщивание зародыша, образование зер­нистости. Более точен метод, основанный на появлении движений онкосферы при резкой смене температур: от 5-10 до 38-40 °С.

Определение жизнеспособности незрелых нематод следует изу­чать во влажной камере (чашках Петри), помещая яйца аскарид в 3 % раствор формалина, приготовленный на изотоническом раство­ре натрия хлорида при температуре 24-30 °С, яйца власоглавов в 3 % раствор соляной кислоты при температуре 30-35 °С, яйца ост­риц в изотонический раствор натрия хлорида при температуре 37 “С. Чашки Петри следует открывать 1-3 раза в неделю для луч­шей аэрации и снова увлажнять фильтровальную бумагу чистой водой.

Наблюдения за развитием яиц гельминтов ведут не реже 2 раз в неделю. Отсутствие признаков развития в течение 2-3 мес свиде­тельствует о их нежизнеспособности. Признаками развития яиц гель­минтов являются сначала стадии дробления, деление содержимого яйца на отдельные бластомеры. В течение первых суток развивает­ся до 16 бластомер, которые переходят во вторую стадию - морулу и т.д.

Яйца анкилостомид культивируют в стеклянном цилиндре (вы­сотой 50 см и диаметром 7 см), закрытом пробкой. Смесь из рав­ных объемов стерильного песка, древесного угля и испражнений с яйцами анкилостомид, разведенную водой до полужидкой консис­тенции, осторожно наливают на дно цилиндра при помощи стеклян­ной трубки. В течение 1-2-суточного отстаивания в темноте при температуре 25-30 °С из яиц вылупляются рабдитовидные личин­ки, а через 5-7 сут они становятся уже филяриевидными: личинки выползают вверх по стенкам цилиндра, где видны даже невооружен­ным глазом. Естественно развивающиеся в воде яйца трематод, на­пример описторхов, дифиллоботриид, фасциол и др., помещают на часовое стекло, чашку Петри или в другой сосуд, наливают неболь­шой слой обычной воды. При культивировании яиц фасциол сле­дует учесть, что они быстрее развиваются в темноте, при этом в живых яйцах при температуре 22-24 °С через 9-12 сут формиру­ется мирацидий. При микроскопировании развивающихся яиц тре­матод хорошо заметны движения мирацидия. Мирацидий фасциолы из оболочек яйца выходит только на свету. При культивирова­нии воду меняют через 2--3 сут.

Личинки анкилостомид и стронгилоид культивируют на агаре в чашке Петри с животным углем. После нахождения в термостате при температуре 26-30 °С в течение 5-6 сут личинки расползают­ся по агару, оставляя за собой дорожку из бактерий (метод Фюллеборна).

Метод Harada и Mori (1955). В пробирки, помещенные в штатив, добавляют 7 мл дистиллированной воды. Деревянной палочкой бе­рут 0,5 г испражнений и делают мазок на фильтровально# бумаге (15X150 мм) в 5 см от левого края (эту операцию проводят на листе бумаги, чтобы защитить поверхность лабораторного стола). Затем полоску с мазком вставляют в пробирку так, чтобы свободный от мазка левый конец достигал дна пробирки. Верхний конец накры­вают куском целлофана и плотно обхватывают резинкой. На про­бирке пишут номер и фамилию обследуемого. В таком состоянии пробирки хранят в течение 8-10 сут при температуре 28 °С. Для изучения культуры снимают и удаляют целлофановую покрышку и извлекают пинцетом полоску фильтровальной бумаги. При этом следует проявлять осторожность, так как небольшое количество инвазионных личинок может передвигаться к верхнему концу филь­тровальной бумаги или к стенке пробирки и проникать под повер­хность целлофана.

Пробирки помещают в горячую водяную баню при температуре 50 °С на 15 мин, после чего содержимое их встряхивают и быстро переливают в 15-миллилитровую пробирку для осаждения личинок. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а оса­док переносят на предметное стекло, накрывают покровным стек­лом и микроскопируют под малым увеличением.

Для дифференциального диагноза филяриевидных личинок не­обходимо пользоваться данными, представленными в табл. 13.

Методы окрашивания яиц и личинок гельминтов. Мертвые тка­ни в большинстве случаев воспринимают краски быстрее, чем жи­вые. Эти особенности используют в гельминтологии для определе­ния жизнеспособности яиц и личинок гельминтов. Однако в отдель­ных случаях некоторые краски лучше воспринимаются живыми тканями, чем мертвыми.

Таблица 13. Дифференциальная диагностика филярневидных личинок A.duodenale, N.americanus, Strongyloides stercoralis, Trichostrongylus spp.

Для дифференциального распознавания живых и мертвых яиц и личинок применяют следующие краски и способы.

Для окраски живых и мертвых тканей используют лейкобазу метиленового синего. Живая клетка или ткань редуцируют метиле­новый синий в бесцветную лейкобазу, мертвая ткань не обладает такой способностью, поэтому приобретает окраску.

Для окраски яиц аскарид можно использовать метиленовый си­ний в растворе молочной кислоты с едкой щелочью (метиленового синего 0,05 г, едкого натра 0,5 г, молочной кислоты 15 мл). Живые яйца окраску не воспринимают, зародыши мертвых яиц окрашива­ются в синий цвет.

Метод окрашивания неприменим для незрелых яиц аскарид и власоглавов; пигментированная оболочка прокрашивается, и поэтому не видно, окрасилась ли зародышевая клетка внутри яйца.

Окрашивание личинок аскарид основным раствором краски бриллианткрезилового синего в концентрации 1:10 ООО осуществля­ют следующим образом: на предметное стекло наносят каплю жид­кости с яйцами аскарид и каплю основного раствора краски. Пре­парат накрывают покровным стеклом, которое плотно прижимают к предметному при легком постукивании препаровальной иглой. Под микроскопом наблюдают количество вышедших личинок и степень их окрашиваемости, после чего этот же препарат просмат­ривают повторно через 2-3 ч. Живыми считаются только недеформированные личинки, не окрасившиеся в течение 2 ч. Мертвые ли­чинки окрашиваются при разрыве скорлупы (частично или полно­стью).

Указывается на возможность окраски препаратов раствором йода при определении жизнеспособности яиц аскаридий птиц. В ка­честве красителя в этом случае используют 5 % спиртовой раствор йода. При его нанесении на препарат зародыши мертвых яиц аска­ридий в течение 1-3 с окрашиваются в оранжевый цвет. Мертвые яйца описторха и онкосферы бычьего цепня окрашиваются раство­ром толуидинового синего (1:1000), а мертвые онкосферы бычьего цепня - раствором бриллианткрезилового синего (1:10 000). При этом приобретают цвет зародыши и оболочки как мертвых, так и живых яиц. Поэтому после окраски яйца и онкосферы отмывают в чистой воде и дополнительно окрашивают сафранином (в разведе­нии 1:10 000 10 % раствора спирта). Спирт удаляет краску с оболо­чек, а сафранин придает им красный цвет. В результате живые яйца окрашиваются в красный цвет, зародыш у мертвых - в синий, а оболочка остается красной. Мертвые зародыши онкосфер бычьего цепня быстро, в течение нескольких минут, окрашиваются в ярко-красный или розовый цвет сафранином либо в синий цвет бриллианткрезиловым синим в разведении 1:4000 или же индигокармином в разведении 1:1000-1:2000.

Живые зародыши не изменяются под влиянием этих красок даже спустя 2-7 ч.

Для определения жизнеспособности яиц карликового цепня ре­комендуется использовать следующие краски: 1) бриллианткрезиловый синий (1:8000) - через 1 ч у мертвых яиц особенно ярко окра­шивается онкосфера, которая резко выделяется на бледном или бес­цветном фоне остального яйца; 2) сафранин: в разведении 1:8000 при воздействии в течение 2 ч и 1:5000 - в течение 3-5 ч; 3) 50 % ра­створ пирогалловой кислоты в разведении 1:2 - при воздействии в течение 1 ч при температуре 29-30 “С (чем ниже температура, тем продолжительнее процесс окрашивания).

Живые плероцеркоиды лентеца широкого очень хорошо прокраши­ваются водным раствором (1:1000) нейтральрот в течение 5-20 мин. Для получения стойкой розовой окраски, не исчезающей в течение 5 сут и не влияющей на подвижность плероцеркоидов, обычно дос­таточно 10 мин. Степень окраски контролируют путем просмотра личинок в чистом изотоническом растворе натрия хлорида, для чего плероцеркоидов периодически извлекают из краски. Целесообраз­но применять метиленовый синий для окрашивания мертвых пле­роцеркоидов.

Р.Э.Чобанов и др. (1986) предложили методику определения жиз­неспособности яиц и личинок гельминтов с использованием в каче­стве красителя пигмента «рубрин», получаемого при культивиро­вании плесневого гриба Peniciliium rubrum. Для этого используют 3 % водный раствор красителя.

Процесс окраски яиц и личинок завершается через 1,5 ч. Нежиз­неспособные яйца остриц, бычьего и карликового цепней, анкило­стомид, трихостронгилид приобретают интенсивный розовый цвет, личинки анкилостомид и трихостронгилид - красный. Менее яр­кая окраска наблюдается у яиц аскарид и власоглавов, так как, выделяясь из кишечника, они уже имеют темно-коричневый цвет: Жизнеспособные яйца и личинки не окрашиваются.

Физико-химические методы стимуляции выхода мирацвдия из яиц трематод. Методы разработаны С.М.Герман и С.А.Беэром (1984) для определения жизнеспособности яиц описторхов и дикроцелиумов путем воздействия реакционной среды на яйца. Если они живые, происходит выхождение мирацидия. Методы основаны на физико­химической активации железы вылупления мирацидия и стимуляции двигательной активности личинки. Стимуляция достигается воздей­ствием на яйца трематоды специальной реакционной среды в соче­тании с последовательными приемами - созданием перепада тем­ператур, подсушиванием взвеси яиц, воздействием слабого тока жидкости в исследуемой капле, которые способствуют массовому выходу мирацидиев из яиц.

Определение жизнеспособности яиц описторха по методу Герман, Беэра. Взвесь яиц в воде (водопроводной, отстоявшейся) предвари­тельно охлаждают до 10-12 °С. Все последующие операции осуще­ствляют при комнатной температуре (18-22 °С). В центрифужную пробирку вносят одну каплю (примерно 0,05 мл) взвеси, содержа­щей 100-400 яиц. Пробирки ставят в штатив на 5-10 мин, чтобы осадить яйца. Затем узкой полоской фильтровальной бумаги осто­рожно отсасывают излишек воды до полного ее удаления. В пробир­ку добавляют 2 капли среды, встряхивают, содержимое переносят пипеткой на предметное стекло и оставляют на 5-10 мин, слегка покачивая (или же помещают под фен) для создания слабых токов жидкости в исследуемой капле взвеси. Эта операция, имитирующая перистальтику кишечника моллюска, позволяет активизировать выход мирацидиев. После этого к взвеси добавляют еще 2 капли среды и затем препарат микроскопируют с помощью обычного све­тового микроскопа (Х200). За это время у яиц с жизнеспособным мирацидием должна открыться крышечка, при этом личинка актив­но выходит в среду. Благодаря наличию в ней этанола мирацидий через 3-5 мин обездвиживается, а затем прокрашивается красите­лем, находящимся в среде. В итоге легко обнаруживают и подсчи­тывают мирацидии.

Приготовление реакционной среды. Среду готовят на 0,05 М трис- HCi буфере в оптимальных режимах pH 8,0-9,5. В буфер добавля­ют этанол до 10-13 % и краситель (сафранин, метиленовый синий и другие, работающие в пределах pH) до слабого окрашивания жидкости (например, для сафранина его конечная концентрация составит 1:50 000). Можно использовать и другой буфер, работаю­щий в щелочных пределах pH, например 0,05 М фосфатный (pH 8,5). Следовательно, среда содержит 96 % этанол - 12 частей; краситель (маточный раствор) - 1-10 частей; 0,05 М трис-НС! буфер (pH 8,5-9,5) - до 100 частей. Пример среды: 12 частей 96 % этанола, 1 часть насыщенного раствора сафранина, остальное до 100 частей - 0,05 М трис-HCl буфер, pH 9,5.

Определение жизнеспособности яиц дикроцелиума по методу Гер­ман, Беэра, Стратана. Каплю взвеси, содержащую 100-150 яиц тре­матоды, помещают в центрифужную пробирку на 1-2 мин для осаждения яиц. Затем жидкость осторожно подсушивают с помощью полоски фильтровальной бумаги. Добавляют пастеровской пипет­кой 1-2 капли реакционной среды и инкубируют на водяной бане при 28-30 °С 2-3 мин. Состав среды: 6 частей бутанола, 94 части 0,4 % раствора хлорида натрия или 0,3 % раствора хлорида калия в дистиллированной воде. Яйца в среде переносят пипеткой на пред­метное стекло и оставляют на 1,5-2 ч при комнатной температуре (18-22 °С), при этом каждые 25-30 мин (по мере подсыхания) до­бавляют по 1-2 капли (0,05 мл) раствора бутанола в дистиллиро­ванной воде. После этого препарат микроскопируют при 100-200- кратном увеличении. Жизнеспособность определяют по числу рас­крывшихся яиц с вышедшими мирацидиями. Бутанол проникает через поры оболочки яиц, достигает мирацидиев и активизирует их. Инкубация при отмеченной температуре усиливает этот процесс. Бутанол в концентрации 3-7 % губителен для вышедшего из яйца мирацидия. Перенос взвеси яиц из пробирки на предметное стекло позволяет к моменту выхода мирацидия (через 30-40 мин) снизить концентрацию бутанола за счет улетучивания до безопасного уровня (1,5-0,5 %). Наличие в среде хлорида натрия в концентрации 0,1- 0,5 % (или хлорида калия в концентрации 0,05-0,4 %) обусловли­вает активность вышедшего мирацидия. В отличие от мелких про­зрачных яиц описторха яйца дикроцелиума имеют темноокрашенную оболочку, у них хорошо заметна крышечка, открытая после выхода мирацидия. Поэтому жизнеспособность яиц дикроцелиума удобнее оценивать путем подсчета раскрывшихся яиц, а не окраши­вания и подсчета мирацидиев.

Люминесцентный метод исследования яиц и личинок гельминтов.

Впервые в гельминтологической практике методы люминесцентной микроскопии были применены в 1955 г. При этом сообщалось, что люминесцентная микроскопия дает возможность дифференциро­вать живые и мертвые объекты без повреждения яйца. Для флюо­ресценции использовались не УФ-лучи, а сине-фиолетовая часть видимого света, с обычным микроскопом и предметными стекла­ми; к осветителю «ОИ-18» применялся специальный набор цветных фильтров.

Было установлено, что живые и мертвые яйца аскарид, остриц, карликовых цепней, бычьего цепня, широкого лентеца и других гель­минтов люминесцируют неодинаково. Это явление наблюдается как при первичной люминесценции без применения красителей, так и при окраске флюорохромами (акридиновый оранжевый, корифосфин, примулин,ауролин,сульфат берлерина, трипафлавин,риванол, акрихин и др.).

Неокрашенные живые несегментированные яйца аскарид светятся ярко-зеленым светом с желтоватым оттенком; у мертвых яиц обо­лочка излучает зеленый свет значительно ярче, чем темно-зеленая зародышевая; у яиц аскарид с личинкой проявляется только оболоч­ка, а у мертвых и оболочка, и личинка ярко-желтого цвета.

Непигментированные и несегментированные живые яйца остриц и карликовых цепней излучают зеленовато-желтый свет; у мертвых яиц интенсивно люминесцирует оболочка на фоне темно-зеленой зародышевой массы. При вторичной люминесценции (при окраске акридиновым оранжевым в разведении 1:10 ООО и 1: 50 ООО от 30 мин до 2 ч) оболочка живых и мертвых нематод, трематод и цестод люминесцирует неодинаково.

Скорлупа живых и мертвых Ascaris lumbricoides, Toxocara leonina, Enterobius vermicularis, Hymenolepis nana, H.fraterna, H. diminuta, T.saginatus, D.latum окрашивается в оранжево-красный цвет. Зародыши живых Asc. lumbricoides, T.leonina, H.diminuta, D.latum и онкосферы бычьего цепня люминесцируют тусклым темно-зеленым или серо-зеленым цветом. Мертвые зародыши этих яиц гельминтов излучают «горящий» оранжево-красный свет. Живые личинки ост­риц и токсокар (освобожденные от скорлупы яйца) излучают туск­лый серо-зеленый свет, при их гибели цвет изменяется от головного конца в «горящий» светло-зеленый, затем желтый, оранжевый и, наконец, ярко-оранжевый.

При окраске флюорохромами - корифосфилом, примулином - у мертвых яиц аскарид и власоглавов наблюдается свечение от ли­лово-желтого до медно-красного цвета. Жизнеспособные яйца не люминесцируют, а окрашиваются в темно-зеленый цвет. Живые яйца трематод Paragonimus westermani и Clonorchis sinensis не люминес­цируют после окраски акридиновым оранжевым, а от мертвых яиц исходит желтовато-зеленый свет.

Метод люминесценции может быть применен и для определения жизнеспособности личинок гельминтов. Так, флюорохромированные раствором акридинового оранжевого (1:2000) личинки строн­гилят, рабдитат светятся: живые - зеленым (с оттенком), мерт­вые - ярко-оранжевым светом. Живые личинки трихинелл не светятся или дают слабое свечение при 10-минутной обработке ра­створами изотиоцианата флюоресцеина, аурамина и др. Флюорохромированные мертвые личинки (в концентрации 1:5000) дают яр­кое свечение.

Живые мирацидии, вышедшие из оболочки, излучают тусклый голубоватый свет с еле заметным светло-желтым венчиком ресни­чек, но спустя 10-15 мин после гибели проявляются ярким «горя­щим» светло-зеленым, а затем оранжево-красным светом.

Методы прижизненной лабораторной диагностики гельминтозов:

— гельминтокопрологические исследования;

— гельминтоовоскопические исследования;

— гельминтоларвоскопические исследования;

— иммунобиологическая диагностика;

— диагностическая дегельминтизация и другие методы;

Методы посмертной диагностики:

— патологоанатомические исследования;

— полные и неполные гельминтологические вскрытия органов и тканей (ПГВ и НПГВ).

Прежде чем перейти перечисленных выше вопросов данной темы, считаю уместным дать определение понятия «инвазия» и «инвазионные болезни».

Инвазионные болезни могут протекать как в клинически выраженной форме со значительной смертностью, так и в скрытой (латентной) форме.

В диагностике инвазионных болезней решающее значение имеют лабораторные исследования, в результате которых устанавливается возбудитель.

Рассмотрим методы прижизненной диагностики гельминтозов. Для этого используют как макро- , так и микроскопические исследования, прежде всего фекалий, мочи, крови, дермы, содержимого полостей организма и др. Эти методы гельминто-диагностических исследований, направленные на отыскание и изучение самих гельминтов, их фрагментов Илии яиц и личинок наиболее доказательны и широко применяются для диагностики гельминтозов.

Материал для диагностических исследований должен быть свободен от всяких посторонних примесей и загрязнений, фекалии рекомендуется брать из прямой кишки животного, они должны быть свежими, их следует держать на холоде (не >5 о С), можно также консервировать 5-10 % раствором формалина или карболовой кислоты.

Гельминтоскопия – применяется для обнаружения в фекалиях целых экземпляров гельминтов или их фрагментов, особенно при исследовании на цестодозы кишечника. Этот метод используется также для контроля эффективности проведённой дегельминтизации, для учёта количества изгнанных гельминтов. Для этих исследований необходимо брать всю единовременную порцию фекалий, а с целью учёта эффективности дегельминтизации следует собирать все экскременты, выделенные животным в течение 2-4 суток после обработки. Собранные фекалии предварительно осматривают невооружённым глазом. Затем их помещают в металлический сосуд, разбавляют 5-10 кратным количеством воды, перемешивают и дают некоторое время отстояться, затем верхний слой сливают (до осадка) и снова добавляют воду. Эти манипуляции последовательного промывания и отстаивания проделывают несколько раз. Полученный осадок небольшими порциями исследуют в кюветках (чашках Петри) на белом и чёрном фоне. Всех видимых гельминтов выбирают иглой и исследуют под микроскопом, устанавливая вид.

Гельминтоовоскопия – это методы диагностики гельминтозов в результате обнаружения в материале яиц гельминтов. Для проведения таких исследований применяют следующее оборудование и средства: микроскоп биологический, предметные стёкла, чашки Петри, стакана стеклянные или пластмассовые (диаметром не > 4-5 см), мензурки объёмом 50 мл, фильтрационные ситечки (с капроновой сеткой, чулочной), стеклянные палочки, металлические петли с диаметром кольца 8-10 мм.

Для диагностических исследований используют флотационные растворы. Наилучшей флотационной способностью обладают растворы при температуре 20-22 о С. Плотность раствора уточняем денсиметром. Насыщенный раствор технической селитры или аммония нитрата с плотностью 1,32 (1500 г на 1 литр кипящей воды); натриевой селитры или натрия нитрата с плотностью 1,38 (соотношение соли и горячей воды 1:1); магния сульфата (сернокислая магнезия)с плотностью 1,26-1,28 (920 г на 1 литр горячей воды); натрия тиосульфата или гипосульфита натрия, плотностью 1,38-1,40 (1750 г на 1 литр кипящей воды); сульфат цинка плотностью 1,24 (400 г на 1 литр воды); поваренная соль, плотностью 1,2 (400 г соли в 1 литре воды нагревают до кипения), применяют в холодном состоянии.

Самый простой метод гельминтоовоскопического исследования фекалий – это метод нативного мазка. Небольшой кусочек фекалий помещают на предметное стекло, добавляют 2-3 капли смеси равных частей глицерина и воды, тщательно смешивают, покрывают покровным стеклом и смотрят под микроскопом. Этот метод ненадёжный, так как при слабой инвазии даёт отрицательный результат.

Метод последовательного промывания (метод осаждения, седиментации) применяют для диагностики трематодозов животных, яйца возбудителей которых имеют большой удельный вес и не улавливаются методом всплывания (флотации). Берут 5 г фекалий, смешивают с10 кратным количеством воды, фильтруют через сито или марлю и фильтрат отстаивают 5 минут. Далее жидкость сливают, а к осадку добавляют чистую воду и снова отстаивают 5 минут. До тех пор пока жидкость не станет прозрачной. Жидкость сливают, а осадок исследуют под микроскопом на наличие трематод.

Для диагностики нематодозов и цестодозов чаще всего используют флотационные методы. Наиболее распространённый и чаще применяемый – метод Фюллеборна. Для этого берут 10-20 г фекалий, помещают его в банку или стакан ёмкостью 100-200 мл, тщательно растирают стеклянной или деревянной палочкой в насыщенном растворе поваренной соли. Общее количество добавляемого раствора должно быть примерно в 20 раз больше количества фекалий. Затем фильтруем и оставляем на 30 минут. С поверхности отстоявшейся жидкости металлической петлёй снимаем плёнку и переносим её на предметное стекло, покрываем покровным стеклом и исследуем под микроскопом. Метод Щербовича используют для обнаружения яиц с более высокой плотностью (например, яйца метастронгилид), для чего используют насыщенный раствор сернокислой магнезии. Пробу фекалий (3-5 г) размешивают в воде до получения равномерной взвеси. Фильтруем через ситечко в центрифужную пробирку и центрифугируем 1-2 минуты. Верхний слой сливают, а к осадку добавляют насыщенный раствор сернокислой магнезии, хорошо размешиваем и снова центрифугируем 1-2 минуты. Затем металлической петлёй снимают верхнюю плёнку, помещают её на предметное стекло, накрывают покровным и исследуем под микроскопом.

Метод Котельникова и Хренова. Пробу фекалий (3 г) кладут в стакан и заливают небольшим количеством насыщенного раствора аммиачной селитры, размешиваем стеклянной (деревянной) палочкой и добавляем раствор до 50 мл. Взвесь фильтруем в другой стакан и оставляем на 10-15 минут. Снимаем петлёй 3-4 капли с поверхности, переносим их на предметное стекло и микроскопируем под малым увеличением микроскопа. Обнаруживаем яйца аскарид, трихоцефал, эзофагостом, стронгилоидесов, метастронгилид, неоаскарид, стронгилят органов пищеварения, мониезий и тизаниезий, параскарид, токсокарисов и др.

Метод Н.В. Демидова для диагностики фасциолёза. Пробу фекалий (3г от овец, 5 г от крупного рогатого скота), помещают в стакан, наливают насыщенный раствор хлористого натрия, тщательно размешиваем стеклянной палочкой, отстаивают 15-20 минут. С поверхности удаляют крупные частицы; жидкость отсасывают спринцовкой, или осторожно сливают, оставляют примерно 20-30 мл, к осадку добавляют воду до полного объёма стакана, тщательно размешивают, фильтруют через сито или 1 слой марли; жидкость снова отсасываем, оставляя 15-20 мл осадка; осадок переливают в маленькие конические стаканы, отстаиваем 3-5 минут, жидкость отсасываем и на предметное стекло переносим осадок, исследуя его под малым увеличением микроскопа.

Метод Дарлинга комбинирует процедуры осаждения и флотации. Фекалий смешивают с водой и центрифугируют 3-5 минут. Надосадочную жидкость сливают, а к осадку прибавляют жидкость Дарлинга (глицерин с насыщенным раствором хлористого натрия, 1:1), тщательно размешивают и вторично центрифугируют 3-5 минут. Металлической петлёй снимаем плёнку на предметное стекло, накрываем покровным и исследуют.

Есть ещё много модифицированных методов исследования с целью обнаружения яиц гельминтов. Существуют стандартизированные методы Фюллеборна, Щербовича и др. При всех исследованиях берут одинаковую посуду, одно и то же время отстаивают и центрифугируют пробы, пользуются петлями одинакового диаметра и, сравнивая число яиц в поле зрения микроскопа или в одной капле поверхностной плёнки до и после обработки животных, судят об эффективности проведённой дегельминтизации. Наиболее простой и достаточно точной является методика, предложенная М.Ш.Акбаевым с использованием сетки, изготовленной из фотоплёнки после рентгеновских снимков. Кроме того, используются количественные гельминтоовоскопические исследования.

Метод Стола. В 100 мл колбочку наливают вначале 56 мл воды и отмечают снаружи на уровне её мениска. Потом наливают ещё 4 мл воды и делают новую отметку. Воду выливают, а в градуированную колбочку наливают 56 мл 0,1н раствора едкого натра, добавляют столько фекалий, чтобы уровень жидкости достиг отметки 60 мл. (4 см 3 фекалий), всыпают 10-15 бусинок, тщательно взбалтывают. Сразу же после взбалтывания градуированной пипеткой набирают 0,075 мл или 0,1 мл смеси, наносят на предметное стекло и исследуют под микроскопом, подсчитывая число яиц гельминтов. Количество яиц в 1 см 3 (1 г) фекалий, найденное число яиц умножают на 200 (если исследовали 0,075 мл смеси) или на 150 (если 0,1 мл смеси).

Гельминтоларвоскопические исследования применяются для диагностики диктиокаулёза, мюллериоза и др. протостронгилидозов, а также стронгилятозов пищеварительного тракта жвачных и стронгилоидозов разных животных.

Метод Бермана и Орлова. 10 г фекалий помещают в воронки аппарата Бермана на металлической сетке или завёрнутые в кусочки марли. Заливают водой комнатной температуры и оставляют на 3-6 часов. За это время личинки выползают из пробы в жидкость и опускаются по трубке на дно пробирки. Жидкость из пробирки сливают и отсасывают. Осадок после встряхивания разливают на предметное стекло и микроскопируют при малом увеличении микроскопа. Личинки нематод подвижны и легко обнаруживаются.

Упрощённая модификация метода Бермана (по Шильникову). В стакан с водой кладут пробы фекалий и завёрнутые в марлевые салфетки. Через 3-6 часов пробы вынимают, жидкость отстаивают 10-15 минут, затем пипеткой отсасывают прозрачный слой воды. Затем каплю осадка пипеткой наносят на предметное стекло для микроскопии.

Метод седиментации с центрифугированием. (экспресс-методика по Котельникову и др.). 3-5 г фекалий кладут в пробирки с водой (20-25 о С) и центрифугируют (1000-1500 оборотов в минуту) 2 минуты. Затем воду сливаем, а осадок, встряхнув, выливают на предметное стекло и исследуют на наличие личинок.

Метод Вайда. На предметное или часовое стекло кладут несколько шариков фекалий от овец, коз и добавляют воды температурой 40 о С. Через 4о минут шарики удаляют и исследуют под микроскопом жидкость, оставшуюся на стекле на наличие личинок нематод. Обнаруженных разными методами личинок необходимо дифференцировать.

Исследование крови по Куликову. Из ярёмной вены набирают 20 мл крови и добавляют 2 мл 3,8 % водного раствора лимонно-кислого натрия и отстаивают в течение 20-25 минут. Образуется 3 слоя: нижний – осевшие эритроциты, средний – лейкоциты и личинки нематод и верхний – сыворотка. Тонкой пипеткой, берут содержимое среднего слоя, наносят его каплями на предметное стекло, накрывают покровным и смотрят под микроскопом.

Исследование крови крупного рогатого скота (по Стюарду). Кожу освобождаем от волос, место дезинфицируем. Пинцетом оттягиваем кожу и кривыми ножницами отрезают поверхностный слой. Помещают на предметное стекло в каплю физраствора и тщательно расщепляют препаровальными иглами. Жидкость исследуют под микроскопом.

Исследование кожи лошадей по Р.С.Чеботарёву. На холке, плече, других местах выбирают участок кожи размером 5 см 2 , дезинфицируем спиртом. Захватываем кожу в складку, отрезаем кусочек толщиной 3-4 мм и площадью 2-3 см 2 . Срезы помещают в пробирке и заливают 2-3 мл физраствора и оставляют на несколько часов в термостате при 36-37 о С или при комнатной температуре. Затем содержимое пробирки выливаем на часовое стекло и исследуют под микроскопом, с целью обнаружения личинок онхоцерков.

Иммунобиологическая диагностика. В практике используют аллергические реакции для диагностики тканевых гельминтозов или, так называемых, ларвальных цестодозов, таких как эхинококкоз, ценуроз, цистицеркозы, а также нематодозов как трихинеллёза. Для этого применяют внутрикожную пробу. В качестве антигена рекомендуют жидкость из личинок (пузырей) или экстракты из трихинелл и их личинок.

В настоящее время большое внимание уделяют разработке и использованию серологических реакций, используя в качестве антигенов живых личинок гельминтов. По этому принципу ставят реакции микропреципитации на живых личинках нематод при нематодозах, на церкариях — при трематодозах, на онкосферах и сколексах — при ларвальных цестодозах. Другой принцип серологических реакций связан с использованием соматических антигенов. Применяют реакции гемагглютинации и флоккуляции (агглютинации) с адсорбированными антигенами. В качестве адсорбентов используют кармин, бентонит и латекссинтетическая смола.

Разновидностью серологических реакций являются: реакция сколексопреципитации (РСкП), разработанная Р.С.Шульц и Р.Г.Исмагиловой для диагностики эхинококкоза овец. Другие реакции: РНГА, РЗГА и др.

Диагностическая дегельминтизация является методом макрогельминтоскопи-ческого исследования. Используют её при подозрении на мониезиоз, тизаниезиоз, авителлиноз жвачных, аноплоцефалидозы лошадей, тениидозы плотоядных, дрепанидотениоз водоплавающих птиц, аскаридоз свиней, аскаридиоз кур и др. небольшой группе животных; наиболее подозрительных в заболевании, вводят соответствующий антгельминтик в лечебной или заниженной дозе. За животными наблюдают и проверяют все выделенные экскременты с целью обнаружения гельминтов или их фрагментов, которые в дальнейшем исследуют.

И, наконец, методы исследования других органов.

Исследование мочи: при диоктофимозе почек, капилляриозе мочевого пузыря. Мочу следует предварительно просмотреть макроскопически или при помощи лупы на наличие гельминтов или их фрагментов. Мочу разбавляют пополам дистиллированной водой и центрифугируют 2-3 минуты, жидкость сливают, а осадок наносят на предметные стёкла и исследуют.

Исследование содержимого трахеи птиц: в ней хорошо видны сингамусы или циатостомы, которые обычно имеют яркокрасный цвет.

Исследование камеры глаза. Прижизненная диагностика сетариоза глаз лошадей и крупного рогатого скота — проводят макроскопическим исследованием передней камеры поражённого глаза, где можно видеть свободноплавающих сетарий (5-10 см) и хорошо просвечивает даже через помутневшую роговицу.

Исследование поверхностного соскоба с перианальных складок: палочку или спичку, смоченную 50 % водным раствором глицерина делают соскоб с перианальных складок с внутренней стороны корня хвоста и с области промежности. Соскоб переносят на предметное стекло в 2-3 капли глицерина (1:1 в воде), покрываем покровным стеклом и исследуем под микроскопом на наличие яиц оксиурат.

Методы посмертной диагностики гельминтозов

— патологогистологические исследования. Посмертная диагностика гельминтозов различных стадий их развития в органах и тканях животных. Наиболее совершенная методика гельминтологического вскрытия разработана К.И.Скрябиым. Различают полное и неполное гельминтологическое вскрытие.

Полное гельминтологическое вскрытие – наиболее надёжный метод, позволяющий производить как количественный, так и качественный учёт всех гельминтов, которыми инвазировано животное.

Суть данного метода: после снятия с трупа кожи, тщательно осматривают подкожную клетчатку, затем вскрывают грудную и брюшную полости и извлекают все органы систем: пищеварительную, дыхательную систему, кровеносную, мочеполовую и др.

Органы отделяют и исследуют порознь, при этом используют метод последовательных смывов. Паренхиматозные органы (печень, лёгкие, поджелудочная железа, почки и др.) помещают в отдельную посуду и превращают в фарш, разрывая руками или разрезая на мелкие кусочки ножом или ножницами. Далее этот детрит отмывают водой или физраствором, пользуясь методом последовательных смывов. Полученный осадок изучают небольшими порциями сначала в чёрных, а затем в белых кюветах или в чашках Петри на чёрном и белом фоне. Крупных гельминтов выбирают визуально, а мелких – при помощи ручной лупы с 8-10-кратным увеличением. Собирают гельминтов только кисточкой или препаровальными иглами, но не пинцетом и непальцами.

НПГВ – упрощённое гельминтологическое вскрытие, в процессе которого извлекают из органов и тканей лишь отдельных резко выделяющихся по размерам гельминтов. Его используют также для получения музейного материала.

Гельминтологические исследования объектов внешней среды. Сбор консервирование и пересылка гельминтов. Фиксация, окраска гельминтов и приготовление из них постоянных микропрепаратов. Приготовление музейных макропрепаратов. Лабораторная диагностика трематодозов. Диагностика: фасциолёза, дикроцелиоза, описторхоза, парамфистоматоза, простогонимоза птиц, эхиностомоза уток и гусей.

Введение

Глава I. Классификация гельминтозов

Глава II. Патогенез гельминтозов

1 Основные фазы гельминтозов в патогенезе и клинике

2 Фактор воздействия возбудителя на иммунную систему хозяина

Глава III. Основные принципы диагностики гельминтозов

Глава IV. Макроскопические методы исследования

Глава V. Качественные методы исследования

1 Нативный мазок

2 Метод Като

3 Методы, основанные на принципе осаждения яиц

4 Методы обогащения, основанные на принципе всплывания яиц

5 Методика обнаружения яиц гельминтов в кале методом обогащения

6 Флотационные методы

7 Метод липкой ленты

Глава VI. Количественные методы исследования

1 Метод Столла

2 Метод Красильникова-Волковой

ГлаваЛАВА VII. Методы диагностики протозойных инвазий

1 Нативный мазок

Заключение

Список литературы

ВВЕДЕНИЕ

Развитие малого бизнеса в пищевой промышленности при недостаточном технологическом контроле привел к снижению качества и безопасности пищевой продукции. Появились незаконные точки убоя скота, подпольные производства мясопродуктов, не прошедших ветеринарный контроль. Ухудшению ситуации также способствует выдача сертификатов ветеринарного контроля на пищевую продукцию «на коммерческой основе», снижение качества профосмотров, прием на работу лиц без санитарных книжек.

Ежегодно в мире регистрируется рост численности домашних животных. По данным Российской Кинологической Федерации, около 5млн. породистых собак зарегистрировано в России. В целом, предположительно, в нашей стране около 30 млн. собак, к тому же многие из них безнадзорны. По данным различных исследований до 80% домашних собак заражены глистами. Проблема загрязнения окружающей среды фекалиями этих животных становится все более острой. Обследованиями, проведенными в различных странах, установлена значительная обсемененность почвы в населенных пунктах яйцами гельминтов с колебаниями до 60% положительных проб. Наиболее обсеменены яйцами гельминтов места около мусорных контейнеров, дворики, песочницы детских садов, рынки, ветлечебницы города, подвалы домов.

На сегодняшний день вследствие сложившейся проблемы большое значение имеет диагностика гельминтозов, что особенно важно на ранних этапах заболевания.

Целью нашей работы является теоретическое изучение методов современной диагностики самых распространенных гельминтозов, использующихся на сегодняшний день в клинической практике.

Задачи работы:

выявление наиболее эффективных методов исследования гельминтозов в клинической практике;

Знакомство со статистикой ВОЗ;

определение преимуществ и недостатков разнообразных методов;

выявление наиболее результативного методов;

изучение истории развития гельминтозов

изучение применяющихся и перспективных методов выявления гельминтозов.

ГЛАВА I. КЛАССИФИКАЦИЯ ГЕЛЬМИНТОЗОВ

Во вторую группу входят гельминты (трихинеллы, трематоды), заражение которыми может произойти через мясо животных и рыбу.

Гельминты при питании выделяют в организме хозяина ядовитые вещества, которые мгновенно всасываются в кровь, разносятся по тканям хозяина, воздействуя на его нервную систему и все жизненно важные органы. .

Гельминтозы характеризуются развитием яиц и личинок возбудителей только во внешней среде без участия промежуточных хозяев. Развитие яиц геогельминтов происходит в почве или на овощах и определяется такими факторами, как температура, влажность и аэрация почвы.

Тениидозы - заболевания, связанные с употреблением мясного сырья. При данных заболеваниях человек является окончательным хозяином гельминтов и единственным источником инвазии. Человек заражается при употреблении в пищу мяса, инфицированного личиночной стадией биогельминта. Известны две разновидности цепня: бычий цепень и свиной. При употреблении мяса, зараженного личинками бычьего цепня, у человека развивается заболевание, называемое тениаринхозом. При употреблении мяса, зараженного личинками свиного цепня, развивается тениоз.

Трихинеллез - биогельминтоз, характеризующийся лихорадкой, мышечными болями и аллергическими проявлениями. Заражение человека происходит при употреблении мяса, содержащего инкапсулированные личинки трихинелл.

Дифиллоботриоз - биогельминтоз, характеризующийся поражением желудочно-кишечного тракта и имеющий хроническое течение. Заражение человека происходит при употреблении в пищу недостаточно термически обработанной или малосоленой рыбы и икры, содержащей личинки лентеца.

Описторхоз - биогельминтоз, характеризующийся поражением печени, поджелудочной железы и имеющий хроническое течение. Заражение человека происходит при употреблении малосоленой, слабо провяленной, сырой или недостаточно термически обработанной рыбы, содержащей личинки кошачьей двуустки.

Геогельминтозы - это гельминтозы, возбудители которых проходят развитие без участия промежуточного хозяина. Выделившиеся из организма яйца или личинки геогельминтов развиваются до инвазионной стадии в почве. Представители живой природы (биотическая среда) здесь могут играть только роль механических переносчиков инвазионных личинок. Например, мухи случайно могут переносить яйца или личинок на хоботке или ножке. К геогельминтозам относятся: аскаридоз, трихоцефалез, анкилостомидозы, стронгилоидоз и другие заболевания. ах, собаки - на конечностях, волосах.

ГЛАВА II. ПАТОГЕНЕЗ ГЕЛЬМИНТОЗОВ

По мнению экспертов ВОЗ, гельминтозы в настоящее время в какой-то мере стали «забытыми болезнями» - во всем мире наблюдается недооценка их медико-социальной значимости. Даже в эндемичных странах им уделяется недостаточное внимание, как со стороны органов здравоохранения, так и населения.

2.1 Основные фазы гельминтозов в патогенезе и клинике

В патогенезе и клинике гельминтозов выделяют две основные фазы: острую - первые 2-3 нед после инвазии, а при тяжелом течении - до 2 мес и более, и хроническую - длительностью от нескольких месяцев до многих лет.

.2 Фактор воздействия возбудителя на иммунную систему хозяина

Фактор воздействия возбудителя на иммунную систему «хозяина» продолжает играть значительную роль и в хронической фазе инвазии. Одной из важных причин органных и системных поражений, особенно при тканевых гельминтозах, является образование иммунных комплексов, которые активизируют медиаторные системы (комплемента, цитокинов и др.). Наряду со стимуляцией иммунного ответа гельминты оказывают иммуносупрессивное действие, что способствует их выживанию в организме хозяина. Состояние иммунодефицита при гельминтозах отрицательно влияет на резистентность человека к бактериальным, вирусным и другим инфекциям, способствует их затяжному течению и формированию носительства, снижает эффективность профилактических прививок. Это хорошо показано на частоте брюшнотифозного носительства, заболеваемости туберкулезом и другими хроническими инфекционными болезнями среди населения гиперэндемичных очагов описторхоза.

При клинически манифестных формах гельминтозов первые признаки появляются в разные сроки после заражения: при аскаридозе проявления острой фазы наблюдаются уже на 2-3-й день, при большинстве других гельминтозов - через 2-3 нед, при филяриозах инкубационный период длится 6-18 мес. В ранней острой фазе гельминтозов характерны проявления аллергических реакций: лихорадка, рецидивирующие зудящие высыпания на коже, отеки - от локальных до генерализованных, увеличение лимфатических узлов, миалгия, артралгия, в периферической крови - лейкоцитоз с гиперэозинофилией. На этом фоне нередко развиваются легочный синдром (от незначительных катаральных явлений до астмоидных состояний, пневмонии и плеврита) и абдоминальный синдром (боли в животе и диспептические расстройства). Увеличиваются в размерах печень и селезенка, возможны разной степени выраженности симптомы и синдромы поражения центральной нервной системы (ЦНС). При некоторых гельминтозах наблюдаются также специфические признаки: при трихинеллезе в типичных случаях с первых дней болезни наблюдается симптомокомплекс, включающий лихорадку, боли в мышцах, отек век и лица; при трематодозах печени (описторхоз, фасциолез) - желтушный синдром, увеличение печени и селезенки. Даже среди гельминтозов, вызванных близкими видами возбудителей, отмечаются существенные различия в тяжести течения и характере проявлений острого периода: так, при японском шистосомозе он развивается намного чаще и протекает тяжелее, чем при мочеполовом и кишечном шистосомозах.

Большим полиморфизмом клинических проявлений характеризуется стронгилоидоз, при котором наряду с разнообразными аллергическим и диспептическим симптомами у больных нередко наблюдаются признаки нарушения функции желчевыводящих путей. При трематодозах печени (описторхоз, клонорхоз, фасциолез) развиваются хронический холецистохолангит, гепатит, панкреатит, возможны поражения различных отделов желудочно-кишечного тракта, наблюдаются также неврологические нарушения. Характерным признаком мочеполового шистосомоза является «терминальная гематурия» (появление капельки крови в конце мочеиспускания) и дизурические расстройства. У больных филяриозами в той или иной степени выражен аллергический синдром, для лимфатических филяриозов (вухерериоз и бругиоз) характерны лимфоаденопатия, лимфангит и лимфостаз, при онхоцеркозе наряду с этими симптомами отмечаются серьезные поражения глаз.

Кишечные цестодозы (дифиллоботриоз, тениаринхоз, тениоз, гименолепидоз) во многих случаях протекают бессимптомно, проявляясь только отхождением зрелых члеников гельминта при дефекации или самостоятельно (только при тениаринхозе). У больных дифиллоботриозом развивается анемия, обусловленная дефицитом витамина В12. Среди гельминтозов особое место занимают ларвальные цестодозы: эхинококкоз, альвеококкоз, цистицеркоз. Они также могут длительное время протекать бессимптомно даже при наличии кист довольно крупных размеров. В то же время разрыв или нагноение даже небольшого эхинококкового пузыря ведет к тяжелым последствиям: развитию анафилактического шока, гнойного перитонита, плеврита и т. п. В результате сдавливания растущим пузырем или альвеококком портальной и нижней полой вены развивается портальная гипертензия со всеми характерными проявлениями и последствиями.

Цистицеркоз ЦНС протекает в виде церебрального, спинального поражений с соответствующей разнообразной симптоматикой; локализация гельминта в желудочках мозга сопровождается признаками внутричерепной гипертензии. Токсокароз, регистрируемый в нашей стране преимущественно у детей, клинически выражается абдоминальным, легочным синдромами, неврологическими нарушениями, поражением глаз, выраженной эозинофилией в периферической крови. .

В последние годы в изучении механизмов развития патологического процесса при гельминтозах достигнуты большие успехи.

ГЛАВА III. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ДИАГНОСТИКИ ГЕЛЬМИНТОЗОВ

По данным ВОЗ, точность диагнозов по анализам кала не превышает 5-10%.

Основным методом лабораторной диагностики этих инвазий является обнаружение яиц или личинок гельминтов.

Испражнения для анализов должны доставляться в лабораторию не позднее одних суток после их выделения, а при подозрении на стронгилоидоз - немедленно

В настоящее время преобладают малоинтенсивные инвазии, особенно при геогельминтозах, поэтому при копроовоскопии необходимо пользоваться методами обогащения.

Однако во главу диагностики еще до лабораторного обследования должны быть поставлены обязательные сведения, полученные при изучении у больного эпидемиологического, географического, социального анамнеза и анамнеза болезни.

Несмотря, на первый взгляд, казалось бы бессимптомное течение многих глисто-протозойных инвазий, у большенства инвазированных при тщательном врачебном обследовании удается выявить немаловажную симптоматику.

Поэтому результаты опроса больного, наиболее полные анамнестические данные, наличие даже легкой симптоматики в большинстве случаев на 79-80%вероятности определяют возможность постановки диагноза при таких инвазиях, как энтеробиоз, тениидозы, дифиллоботриоз, нередко при аскаридозе и описторхозе. А самое главное эти данные определяют конкретные показания к проведению лабораторной диагностики: правильному выбору методики, соответствующей подготовки больного, забору для исследования необходимого биологического материала (жидкостей или экскретов).

Большой популярностью среди основных методов исследования на сегодняшний день используются иммунологические методы диагностики, а также ПЦР - для выявления ДНК возбудителей. Иммунологические методы диагностики гельминтозов основаны на обнаружении в сыворотке крови специфических антител к тем или иным гельминтам. Для иммунологического исследования применяется метод непрямой гемагглютинации, иммуноферментного анализа, иммуноэлектрофореза, иммуноабсорбции и другие серологические методы исследований крови.

Иммунологические методы исследования применяются для диагностики альвеококкоза, эхинококкоза, цистицеркоза, аскаридоза, шистосомоза и других гельминтозов как вспомогательные в комплексе с методами клинико-инструментальной диагностики. Данные методы исследования можно считать эффективными только в том случае, когда гельминты располагаются непосредственно в тканях человеческого организма.

Биологическим материалом для исследований на наличие гельминтов, их фрагментов, личинок и яиц служат фекалии, моча, дуоденальное содержимое, желчь, мокрота, ректальная и перианальная слизь, кровь, мышечная ткань. С учетом преобладающей локализации большинства наиболее распространенных гельминтов в желудочно-кишечном тракте, чаще всего объектом исследования являются фекалии. Макроскопические методы применяют для обнаружения выделенных гельминтов или их фрагментов: головки, обрывки стробилы или отдельные членики. Целью микроскопических исследований является обнаружение яиц и личинок. В настоящее время рекомендованы к применению толстый мазок по Като-Миура, методы седиментации, методы флотации.

Нативные и концентрированные препараты фекалий: яйца гельминтов-аскарид, власоглава, карликового цепня, широкого лентеца, токсокар, трематод -кошачьей, сибирской двуусток, и т. д.

В нативных необработанных фекалиях или жидких при промывании невооруженным глазом можно обнаружить целых или фрагменты взрослых аскарид, остриц, членики бычьего цепня, свиного цепней, отрывки стробилы широкого лентеца.

В пробах мочи: яйца шистосом, трихомонады, яйца диактофим, дочерние капсулы эхинококка, при эхинококкозе почек.

В соскобах кожи с перианальной области: яйца остриц, яйца (онкосферы) теннид.

В мокроте: личинки стронгилид, аскарид, токсокар, дочерние капсулы эхинококка при эхинококкозе легких, амебы при легочном амебиазе.

В пробах дуоденального содержимого (двенадцатиперстной кишки): личинки и даже яйца стронгилид, трофозоиды лямблии, яйца трематод(кошачьей, китайской, печеночного, ланцетовидной двулисток).

В пробах спинномозговой жидкости: трипаносомы, личинки нематод ангиостронгилид.

В мазках из влагалищной слизи: трихоманады, трофозоиты кишечной амебы, иногда яйца остриц и даже взрослой особи.

В молоке матери в особых случаях: личинки стронгилид.

Нативные тканевые препараты (аспирационный материал из бронхов, костного мозга, лимфатических узлов, абсцессов, соскобы со слизистых, биопсия) путем обработки специальными методами применяется в дополнение или взамен гистологических исследований для диагностики трипаносомоза, пневмоцистоза, трихинеллеза.

Кал для анализа кала на обнаружение гельминтов необходимо собирать правильно, следуя рекомендациям:

Перед сбором воспрещено делать клизму и употреблять любые слабительные средства;

При дефекации кал следует собирать на полиэтиленовую пленку или в лоток. При этом нельзя допускать попадания на образец мочи, выделений, воды, предметов личной гигиены и пр. ;

Если в лабораторию анализы сразу отправить не получается, то хранить материал необходимо при температуре 4-8 градусов Цельсия. При этом в лабораторию анализы должны попасть в этот же день.

По возможности следует собрать несколько образцов кала, из разных дефекаций в течение одного дня.

ГЛАВА IV. МАКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Осмотр фекалий при помощи лупы или невооруженным глазом.

Ход исследования. Фекалии размешивают с водой до получения равномерной суспензии, после чего при освещении тщательно просматривают небольшими пропорциями в черных фотографических кюветах или на темном фоне в чашках Петри. В случае обнаружения подозрительных частиц или когда заведомо предполагают наличие мелких форм гельминтов (например остриц), все подозрительные белые частицы пинцетом или препаровальными иглами переносят на предметное стекло в каплю глицерина, изотонического раствора хлорида натрия или воды и исследуют невооруженным глазом под лупой или под микроскопом. При обнаружении подозрительных образований, следует рассмотреть их под лупой, предварительно сжав их между двумя предметными стеклами.

Метод отстаивания. Ход исследования. Весь исследуемый материал (в данном случае свежих фекалий) помещают в высокие банки, разбавляют сильной струей воды и оставляют отстояться. Мутный слой над осадком с осторожностью переливают в другой сосуд, осадок вновь разбавляют и смесь отстаивают. Данные операции выполняются до тех пор, пока вода над осадком не станет прозрачной. Воду сливают, а осадок исследуют маленькими частями в чашках Петри на темном фоне.

Оценка полученных результатов. Дифференциальная диагностика между гельминтами основывается на их анатомо-морфологических признаках. Определение принадлежности нематод, как правило, возможно лишь по цельным особям, реже - по достаточно большим фрагментам, которые сохранили свои характерные диагностические признаки. Цестоды чаще всего диагностируют по зрелым или гермафродитным сколексам и членикам .

Микроскопические методы исследования

Целью микроскопических методов является выявление яиц и личинок гельминтов. Данные методы подразделяются на качественные и количественные.

ГЛАВА V. КАЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

.1 Нативный мазок

Метод предложенный Давеном в 1853г. - один из самых старых и самых простых методов данной группы, но в литературе имеются многочисленные высказывания, указывающие на его низкую эффективность, по сравнению с другими методами.

МЕТОДЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕЛЬМИНТОВ.

Аскаридоз можно обнаружить методами: копроовоскопические мазок на Като, унифицированные методы обогащения Фюллеборна, Калантарян и др. флотационные методики.

5.2 Метод Като

Метод Като (толстый мазок с целлофаном) - последователь нативного мазка. Данный метод очень удобен при массовых обследованиях, мазки могут быть приготовлены на месте. Этот метод основывается на выявлении гельминтов в просветленном глицерином и окрашенном малахитовой зеленью мазке фекалий. Чтобы осуществить этот метод, необходим целлофан смесь Като, состоящая из 6 миллилитров 3% раствора малахитовой зелени в воде, 500 миллилитров глицерина, 500 миллилитров 6% раствора фенола.

Ход исследования. Целлофановые полоски меньше предметного стекла вырезают из гидрофильного целлофата и предварительно обрабатывают, погружая их в раствор Като: глицерин размягчает целлофан, осветляет препарат и предохраняет его от высыхания; фенол используется для защиты лаборанта от патогенных бактерий; малахитовая зелень уменьшает напряжение глаз. Полоски располагаются в растворе Като так, что они прилежат друг к другу (3-5 мл на 100 полосок). Через 24 часа полоски готовы к дальнейшим действиям. Они могут очень продолжительное время храниться в указанной смеси, в герметичной посуде.

миллиграмм фекалий укладывают на предметное стекло толстым слоем, накрывают полоской целлофана и придавливают на предметном стекле резиновой пробкой таким образом, чтобы фекалии не выдавились из-под целлофана.

Исследование мазка следует проводить не позже чем через час после его приготовления. За небольшой промежуток времени (в течении часа) при комнатной температуре мазок становится более прозрачным.

При отсутствии реактивов для приготовления смеси Като ее можно заменить 50% водным раствором глицерина.

Выявление яиц проводится под микроскопом во всем толстом мазке.

Диагностическое значение. Наиболее эффективен метод Като для диагностики тениаринхоза. Так же можно выявить яйца аскарид, власоглавов, трематод и других. Но данный метод не эффективен в диагностике гименолепидоза, анкилостомидозов и трихостронгилоидоза.

.3 Методы, основанные на принципе осаждения яиц

Данные методы в настоящее время не рекомендуются в качестве унифицированного из-за малой их эффективности или громоздкости. Из этой группы методов выделяется метод исследования фекалий на яйца гельминтов с использованием синтетических детергентов (синтетических моющих средств типа «Лотос»). Под действием поверхностно-активных веществ, входящих в состав детергентов, яйца гельминтов освобождаются от кала и концентрируются в осадке.

В качестве реактива используют 1 % раствор стирального порошка (порошок высушивают в сушильном шкафу при 100 °С в течение 1-2 ч, 10 г порошка растворяют в 1 л водопроводной воды).

Существуют две методики:

методика - В склянку емкостью 30-50 мл наливают 20-30 мл раствора детергента, туда же помещают порцию кала размером с лесной орех. Кал для исследования желательно помещать в раствор детергента не позже чем через 1 ч после дефекации. Соотношение раствора и кала примерно 1: 2. Кал должен находиться в растворе не менее суток. За это время на дне флакона образуется двух-, трехслойный осадок. Нижний слой состоит из грубых тяжелых частиц, в среднем слое концентрируются яйца гельминтов, на которые иногда оседают легкие хлопья. Пастеровскую пипетку с высоко отбитым концом вводят в средний слой осадка, возможно более низко, но не касаясь дна склянки, набирают одну-три капли жидкости и переносят их на предметное стекло. Каплю накрывают покровным стеклом или целлофановой пластинкой по Като и исследуют под микроскопом. На одном стекле должно быть приготовлено два препарата.

методика - Кал помещают в раствор детергента в соотношении примерно 1: 10 и перемешивают до образования суспензии. Через 30 мин содержимое пробирки встряхивают 1-2 мин и центрифугируют 5 мин при 1000-1500 об/мин. Из осадка готовят два препарата на одном предметном стекле.

Просматривают под микроскопом полностью оба препарата, учитывая все обнаруженные яйца гельминтов.

Диагностическое значение: Данным методом можно выявить яйца всех видов гельминтов.

Метод Фюллеборна. Данный метод основан на всплывании яиц гельминтов в насыщенном растворе NaCl с высокой относительной плотностью. Для этого растворяют 400 г NaCl в 1 л воды при кипячении. Относительная плотность раствора 1, 18-1, 22. Раствор хранят в закрытой бутыли.

Для проведения анализа в банку объемом 30-50 мл помещают 2-3 г испражнений и при помешивании палочкой доливают почти доверху насыщенный раствор хлорида натрия. Полоской бумаги быстро удаляют всплывшие крупные частицы.

Через 45-60 мин. отстаивания проволочной петлей снимают поверхностную пленку и переносят ее на предметное стекло в каплю 50% водного раствора глицерина. Готовят несколько препаратов. Дополнительно просматривают 2-4 препарата из осадка, набирая его глазной пипеткой на 2 предметных стекла.

Необходимость исследования осадка обусловлена тем, что яйца трематод и тениид всплывают очень плохо и могут остаться в осадке. Хорошо всплывают яйца нематод (за исключением неоплодотворенных яиц аскарид), карликового цепня и лентеца.

К достоинствам этого метода относится его дешевизна и доступность к недостаткам - необходимость просмотра препаратов из поверхностной пленки и осадка, а также длительность отстаивания.

.4 Методы обогащения, основанные на принципе всплывания яиц

Методы этой группы основаны на всплывании яиц гельминтов в растворе, имеющем по сравнению с ними большой удельный вес.

Метод Калантарян. Кал суспензируютво флотационном растворе, имеющем большую относительную плотность, чем яйца гельминтов. При этом яйца гельминтов всплывают на поверхность, образовавшуюся пленку исследуют под микроскопом.

В качестве реактива используют флотационный раствор по Калантарян (1 кг нитрата натрия растворяют в 1 л воды, кипятят смесь до образования пленки и переливают без фильтрования в сухие бутылки; относительная плотность раствора 1, 38) либо флотационный раствор по Брудастову - Красноносу (900 г нитрата натрия и 400 г нитрата калия растворяют при подогревании в 1 л воды; относительная плотность раствора 1, 47-1, 48).

Недостаток метода - высокая стоимость азотнокислого натрия.

Метод Горячева. Данный метод(метод осаждения) используется для диагностики описторхоза. Удельный вес яиц описторха высок, поэтому они не всплывают в солевых растворах. В цилиндр диаметром 2-3 см наливают 70-100 мл насыщенного раствора хлорида натрия.

Отдельно тщательно размешивают 0, 5 г испражнений в 20-25 мл воды и осторожно фильтруют через воронку с двумя слоями марли в цилиндр на солевой раствор, избегая перемешивания. Яйца описторхов медленно оседают на дно цилиндра.

Через 2-3 часа верхний слой с калом отсасывают пипеткой, а оставшийся солевой раствор оставляют стоять на 12-20 часов или центрифугируют. Осадок пипеткой переносят на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и микроскопируют. Этот метод применим и для диагностики других трематодозов.

.5 Методика обнаружения яиц гельминтов в кале методом обогащения

В химических стаканах тщательно размешивают стеклянной палочкой 5-10 г кала и 100- 200 мл одного из флотационных растворов. Сразу же после окончания размешивания удаляют стеклянной палочкой всплывшие на поверхность крупные частицы. К поверхности солевого раствора прикладывают предметное стекло. Если между смесью и предметным стеклом остается пустое пространство, то добавляют солевой раствор до полного соприкосновения смеси с предметным стеклом.

Оставляют для отстаивания на 20-30 мин, после чего предметное стекло снимают, кладут под микроскоп пленкой кверху и просматривают без покровного стекла всю пленку, прилипшую к поверхности предметного стекла. Во избежание высыхания во время исследования пленку можно смешать с двумя-тремя каплями 50 % раствора глицерина.

Учитывают все обнаруженные в препарате яйца гельминтов.

Диагностическое значение: описанным методом можно выявить заражение аскаридами, власоглавами, анкилостомидами, тениидами, трематодами, лентецами и другими видами гельминтов.

5.6 Флотационные методы

В настоящее время для диагностики описторхоза (клонорхоза) рекомендуют методы Като и Калантарян, как достаточно эффективные и технически более простые.

5.7 Метод липкой ленты

Метод липкой ленты используется для диагностики энтеробиоза. Кусочек липкой прозрачной полиэтиленовой ленты длиной 4-5 см липким слоем прикладывают через анус к перианальным складкам, сразу же снимают и приклеивают на предметное стекло. Полученные таким образом препараты микроскопируют.

Преимущества этого метода перед соскобом с перианальных складок заключается в быстроте и возможности довольно долгого хранения препаратов.

ГЛАВА VI. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Количественные методы исследования применяются при определении интенсивности инвазии, оценке эффективности различных антигельминтных препаратов, определении качества дегельминтизации, контроле проводимых массовых лечебно-профилактических мероприятий и др.

Количественное определение яиц гельминтов исследуется двумя методами: методом Столла и методом Красильникова и Волковой (1974).

.1 Метод Столла

Метод стола используется при аскаридозе. Необходимое оборудование: микроскоп, стеклянная колба с отметкой 56 и 60 миллилитров, мерный цилиндр, стеклянные бусы, резиновая пробка для колбы, градуированные пипетки, предметные стекла и 0, 4% раствор едкого натра.

Ход исследования. В колбу с мерным цилиндром наливают децинормальный раствор едкого натра до отметки 56миллилитров и добавляют испражнения до тех пор, пока уровень жидкости не поднимается до отметки 60 миллилитров (получается 4 миллилитра испражнений). Данную смесь взбалтывают со стеклянными бусами на протяжении одной минуты, предварительно закрыв колбу резиновой пробкой (можно перемешать и палочкой). Сразу после взбалтывания набирают градуированной пипеткой 0, 075 миллилитров смеси (в ней содержится 0, 005 миллилитров испражнений), переносят на предметное стекло и подсчитывают количество яиц в препарате под микроскопом. Для того, чтобы определить количество яиц в 1 грамме испражнений, обнаруженное число умножают на 200.

Сравнение числа яиц в пробе, обнаруженное у больного перед лечением и после него, позволяет рассуждать об эффективности дегельминтизации.

Данный метод довольно прост и даёт сравнимые результаты при всех гельминтозах, возбудители которых систематически выделяют яйца в кишечник больного. Однако метод имеет весомый недостаток - относительно низкая чувствительность, особенно при слабой интенсивности инвазии.

.2 Метод Красильникова-Волковой

При исследовании этим методом берут не менее 1 грамма испражнений и смешивают в стеклянной колбочке или большой пробирке с 1% раствором «Лотоса» (можно взять 1, 5% раствора «Экастра») в отношении 1: 10. Взвесь тщательно взбалтывают до образования гомогенной суспензии, сразу после этого набирают градуированной пипеткой 0, 1 миллилитр взвеси (примерно равняется 0, 01 грамм фекалий) и переносят на предметное стекло. Данный препарат покрывают покровном стеклом или целлофановой пластинкой (20 х 30 мм), выдержанной не менее одних суток в 50% водном растворе глицерина.

Подсчитывается число яиц во всем препарате под микроскопом. Чтобы рассчитать количество яиц в одном грамме испражнений полученное число умножают на 100.

Данный метод более эффективен, чем метод Столла. Во-первых, он более чувствителен и позволяет обнаруживать гельминтов при слабой степени инвазии. Во-вторых, он очень удобен при массовых обследованиях, так как растворы детергентов, являются консервантами яиц гельминтов, позволяют проводить исследования и не совсем свежего материала. Однако обязательным условием при этом является сбор фекалий непосредственно в раствор детергента.

Для количественного исследования можно применять любой из описанных унифицированных качественных методов, основанных на принципе всплывания яиц. Но в этом случае для анализа должно быть взято одно и то же количество фекалий, один и тот же объем флотационного раствора. Расчет степени инвазии можно произвести, зная количество яиц в 1 грамме фекалий.

ГЛАВА VII. МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИПРОТОЗОЙНЫХ ИНВАЗИЙ

.1 Нативный мазок

На предметное стекло наносят по 1-2 капли изотоничского раствора в двух местах с небольшим промежутком.

Деревянной палочкой из пробы фекалий выбирают небольшой кусочек и переносят в каплю на предметное стекло, размешивая до образования однородной массы. Далее сверху кладут покровное стекло и рассматривают под микроскопом.

Через хорошо приготовленный препарат должен быть виден печатный текст.

При исследовании кала у больных обнаруживаются просветные формы - цисты. В остром периоде болезни обнаруживаются большие вегетативные формы амеб - эритрофаги (гематофаги), которые быстро погибают во внешней среде. Данные приведены ниже:

Вид инвазииЧисло яиц в 1г фекалийЧисло гельминтов в кишечникеСтепень инвазииАскаридоз1-10001-10Слабая10001-5000011-50Умеренная50001-1900051-200ТяжелаяСвыше 190000Свыше 200ОченьтяжелаяТрихоцефалез1-20001-25Оченьслабая2001-750026-100Слабая7501-37500101-500Умеренная37501-75000501-1000ТяжелаяСвыше 75000Свыше 1000ОченьтяжелаяАнкилостомоз1-25001-25Оченьслабая2501-1000026-100Слабая10000-50000101-500Умеренная50001-100000501-1000ТяжелаяСвыше 100000Свыше 1000ОченьтяжелаяНекатороз1-6001-25Оченьслабая601-210026-100Слабая2101-11000101-500Умеренная11101-22100501-1000ТяжелаяСвыше 22100Свыше 1000Оченьтяжелая

При серологическом исследовании определяют наличие антител к гельминтам (достоверность - около 60 %): при подозрении на эхинококкоз, цистицеркоз, трихинеллез, токсокароз широко используют реакции непрямой гемагглютинации, агглютинации латекса, связывания комплемента, иммунофлюоресценции.

Не во всех случаях методы определения специфических антител обладают достаточной специфичностью и достоверностью. Антигенный состав гельминта зависит не только от вида, но и от стадии; проходя сложный цикл развития от яйца до взрослой особи, гельминты меняют антигенный состав. Кроме того, в иммунодиагностических реакциях используются соматические антитела, а в организме хозяина антитела вырабатываются в основном на экскреты и секреты гельминта. Неспецифическая сенсибилизация организма, общность некоторых антигенов трематод, простейших и человека создают высокий удельный вес ложноположительных реакций в титрах ниже достоверно диагностических.

Метод определения гельминтов с помощью полимеразной цепной реакции является высокоспсцифичным и высокочувствительным, но из-за дороговизны и сложности не может быть скрининговым, когда, например, нужно обследовать группу детей из детского учреждения.

Иммунная система не всегда реагирует (распознает и уничтожает) но наличие гельминтов в организме. Это объясняется тем, что некоторые гельминты имеют прочною и химически устойчивую капсулу, или покрыты веществом, которое не распознается иммунной системой; локализуются в тканях, наиболее защищенных от воспалительных реакций, например в спинном мозге; многие виды из них в пищеварительном тракте выделяют антиэнзимы, что спасает их от гибели; имеют большую продолжительность жизни (годами, а иногда до смерти самого человека); питаются за счет гликолиза чистых углеводов; имеют такие приспособления, как присоски, крючки и др. , что способствует фиксации внутри организма; у многих видов существует половое размножение, при котором происходит обмен генной информацией, что приводит к усилению гетерогенной популяции, уменьшению уязвимости; обладают высоким уровнем плодовитости. Данные методы исследования можно считать эффективными только в том случае, когда гельминты располагаются непосредственно в тканях человеческого организма. В данном случае применяют: кожную и внутрикожную пробу, реакцию кольцепреципитации, непрямую гемагглютинацию и так далее.

В крови инвазированных лиц происходит увеличение титров специфических антител, сначала IgM-, а затем IgG-классов. Если это не реинвазия, то в организме больного с аллергическими проявлениями еще отсутствуют гельминты в репродуктивной стадии развития, и диагностика гельминтоза невозможна. Период созревания гельминта может быть достаточно продолжительным и зависит от многих факторов. !!! На этой стадии диагностика заболевания возможна только по выявлению антител к антигенам гельминта. Использование высокочувствительного метода иммуноферментного анализа с этой целью оказалось весьма эффективным.

Иммунологические методы используют для выявления шистосомоза, альвеококкоза, цистицеркоза, эхинококкоза, аскаридоза и прочих видов гельминтов.

Сопутствующие обследования также могут подтвердить гельминтозы. Гельминтозы нередко проявляются в анализе на дисбактериоз и общем анализе крови (низкий гемоглобин, повышенная СОЭ, эозинофилия).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время нет простого, доступного и надежного метода диагностики гельминтозов. Выбор того или иного метода зависит от вида гельминта, а также стадии заболевания.

В заключении хочется напомнить о том, что диагностика любого

Важное значение на сегодняшний день в связи с сложившейся ситуацией следует уделить профилактике.

Профилактика гельминтозов включает комплекс мероприятий по выявлению больных, их лечение, обеспечение условий жизни, быта и производства, исключающих распространение этих болезней, охрану и оздоровление окружающей среды от возбудителей. Объем и характер проводимых мероприятий по снижению заболеваемости наиболее распространенными среди населения Российской Федерации геогельминтозами определяются уровнем пораженности, климатическими условиями, особенностями быта и хозяйственной деятельности населения и результатами санитарно-гельминтологического мониторинга, так как геогельминтозы - это в первую очередь санитарная проблема. В основе профилактики трихинеллеза, тениаринхоза, тениоза лежит обеспечение безопасности для здоровья человека мясной продукции, а предупреждение описторхоза, дифиллоботриозов, и других гельминтозов, передающихся через рыбу, ракообразных, моллюсков и пресмыкающихся, состоит в обеспечении гарантированной безопасности рыбной и другой соответствующей продукции. Профилактика и борьба с эхинококкозом и альвеококкозом осуществляется с помощью мер, направленных на предупреждение заражения человека, сельскохозяйственных животных, собак; необходимы санитарное просвещение, проведение регулярного медицинского обследования контингентов риска (оленеводов, звероводов, охотников). В профилактике гельминтозов, передающихся контактным путем (энтеробиоз), основное значение имеют меры, направленные на разрыв механизма передачи их возбудителей, при этом следует учитывать, что эти гельминтозы преимущественно поражают детей в организованных коллективах.

Необходимо соблюдать меры личной профилактики - мыть руки перед едой, после посещения туалета, возвращения с улицы домой, после контакта с животными. Ягоды, овощи, фрукты, зелень нужно тщательно промыть проточной водой и ополаскивать кипяченой водой. Нельзя пробовать сырой мясной или рыбный фарш. Рыбу, морепродукты, мясо следует хорошо прожаривать, тушить или варить. Необходимо помнить о своих домашних животных - не вскармливать им сырую рыбу, мясо, внутренние органы животных, проводить периодически их профилактические лечение (дегельминтизацию).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. М. В. Северин, Д. Н. Понамарев, В. М. Борзунов, Т. Б. Третьякова. Методы диагностики наиболее распространенных протозоозов и гельминтозов Екатеринбург 1996г. -71с.

А. М. Бронштейн, Н. А. Малышев. »Гельминтозы человека» Москва 2010 г. -109с.

Методическое пособие Гельминтозы в практике педиатра Москва 2008г. -30с.

Http: //doctorspb. ru/ медицинский портал для врачей и студентов.

Биология под редакцией академика РАМН, профессора В. Н. Ярыгина: Том 2. Москва издательская группа «ГЭОТАР-Медиа», 2012 - 553с.

Слюсарев А. А. , Жукова С. В. - К. : Вищашк. Головное издательство, 1987-415с.

Http: //www. pasteur-nii. spb. ru/ Гельминтология

12. http: //www. rusnauka. com/17_APSN_2013/Biologia/10_140855. doc. htm

клинико-патогенетические особенности и современное состояние диагностики, лечения Гельминтозов человека

Http: //fersirs. ucoz. ru/news/klassifikacija_gelmintov_klassifikacija_gelmintozov_po_voz/2013-12-19- Классификация гельминтов.

Репетиторство

Нужна помощь по изучению какой-либы темы?

Наши специалисты проконсультируют или окажут репетиторские услуги по интересующей вас тематике.
Отправь заявку с указанием темы прямо сейчас, чтобы узнать о возможности получения консультации.

Главная » Детский сад » Законодательная база российской федерации. Гельминтологические методы исследования