Анализ ифа суммарный. Иммуноферментный анализ (ИФА)
Иммуноферментный анализ крови – одно из важнейших исследований, проводимых для оценки способности организма человека противостоять атаке болезнетворных микроорганизмов. Оно позволяет понять, насколько хорошо иммунная система справляется с инфекционными процессами. Это, в свою очередь, дает возможность скорректировать схему лечения, если таковое проводится.
И это еще далеко не все особенности данного теста, поэтому давайте подробно рассмотрим вопросы, что такое ИФА анализ, кому он показан, как он выполняется, и о чем могут говорить полученные данные.
Что это за исследование
Итак, что это такое – ИФА анализ? Расшифровывается данная аббревиатура как «иммуноферментный анализ». Проводится он в том случае, если необходимо определить наличие антител к разного рода антигенам.
Антигенами называются болезнетворные агенты, способствующие развитию различных патологий. Антитела – вещества, которые необходимы для уничтожения чужеродных клеток.
Иммуноанализ крови направлен на определение уровней иммуноглобулинов, которые могут объединяться в иммунокомплексы. Они активно вырабатываются иммунной системой в ответ на внедрение в организм антигенов.
Примечание. Для борьбы с каждым отдельным видом антигена вырабатываются свои специфические антитела. Именно это помогает выявить болезнь, и даже ее стадию, с помощью иммуноферментного исследования крови.
При проникновении чужеродного антигена в организм человека антитела «связываются» с ним, после чего нейтрализуют его воздействие. Происходит это за счет ферментативного лизиса и реакций фагоцитоза. Благодаря такому процессу антигены выводятся из крови.
Когда назначается тест?
Разобравшись в том, что такое иммуноферментный анализ, разберемся в ситуациях, при которых показано его проведение. Так, исследование необходимо при:
- онкологических заболеваниях;
- вирусных гепатитах;
- герпетических высыпаниях на коже или слизистых оболочках;
- сальмонеллезе;
- кори;
- энцефалите;
- сифилисе;
- дизентерии;
- атопических дерматитах или нетипичных проявлениях аллергических реакций.
Помимо этого, метод ИФА применяется для определения и выявления возбудителей:
- заболеваний, передающихся половым путем;
- цитомегаловирусной инфекции;
- гельминтозов.
Иммуноферментный анализ – это исследование, помогающее определить природу эндокринных заболеваний, а также выявить наличие иммунодефицита и бесплодия у мужчин и женщин. С его помощью составляются прогнозы дальнейшего течения инфарктов, инсультов, неврологических и почечных заболеваний.
Проводится ИФА анализ и в профилактических целях. Обязательно его выполняют при беременности, а также пациентам, ранее перенесшим вышеописанные заболевания. Лица, входящие в группу риска развития ранее упомянутых болезней тоже регулярно сдают кровь на ИФА.
Особенности проведения теста и расшифровка
В большинстве случаев для иммуноферментного исследования берется кровь больного. Но при определенных обстоятельствах может осуществляться забор тканей с поверхности стекловидного тела. У беременных женщин ИФА диагностика может проводиться посредством изучения состава околоплодных вод.
Забор крови выполняется с использованием шприца, при этом материал для исследования берут, как правило, из вены, походящей на внутренней стороне локтевого сгиба. Пациент при этом должен находиться в расслабленном состоянии, в положении сидя.
Важно! Результаты теста, его и расшифровка данных зависит от методики проведения диагностической манипуляции, и используемого при этом оборудования. Как правило, каждая лаборатория указывает на бланке нормы показателей иммуноглобулинов.
Особенности подготовки
Анализ крови на ИФА требует выполнения определенных подготовительных процедур:
- отказа от завтрака в день теста;
- прекращения приема препаратов, разжижающих кровь, и других фармакологических средств, способных повлиять на результаты (после предварительной консультации у лечащего врача);
- воздержания от курения в день исследования;
- отказа от употребления спиртного за день до забора крови;
- исключения приема наркотических веществ (в том числе, и медпрепаратов, которые их содержат).
Соблюдение таких правил подготовки к иммунохимическому анализу крови исключает возможность искажения данных.
Трактовка данных
Результаты исследования выдаются пациенту на руки, после чего он проходит повторную консультацию у специалиста. Расшифровка данных ИФА может быть положительной или отрицательной. При этом в расчет также принимаются цифры, обозначающие (если таковые были обнаружены).
Если ИФА отрицательный, это может говорить об отсутствии патологических процессов, либо о начальной фазе их развития. Также «минусовый» результат исследования наблюдается при выздоровлении пациента после пройденного курса терапии. Но подобные данные можно получить только по истечении определенного промежутка времени (1 – 2 месяцев).
Если и IgM в крови отсутствуют, а анализ ИФ показал положительный результат на , это может свидетельствовать о том, что у пациента сформировался стойкий иммунитет к определенному виду антигенов. Подобное происходит при иммунизации.
При высокой концентрации IgM на фоне отсутствия IgG и IgA речь может идти о воспалительном процессе, протекающем в острой фазе.
Что означает, если ИФА положительный для всех видов иммуноглобулинов? В подобных случаях речь может идти о рецидиве инфекционной патологии. При этом возникновение антител фиксируется только при острой фазе хронической болезни.
При переходе заболевания в фазу затухания будут отрицательными. А вот ИФА на IgG и IgA будет положительным.
Плюсы и минусы теста
Исследование крови методом ИФА имеет свои сильные и слабые стороны. К плюсам можно отнести:
- относительно невысокую стоимость;
- точность;
- возможность регулярного проведения с целью оценки эффективности проводимого лечения;
- быстроту выполнения;
- использование высокоточных и высокоинформативных технологий для получения достоверных результатов;
- возможность проведения множественных исследований в области одного и того же очага патологического процесса;
- абсолютную безболезненность;
- отсутствие любых рисков для здоровья пациента;
- относительную простоту исследования.
Исследование крови ИФА, благодаря вышеописанным преимуществам, приобрело широкую распространенность, и играет немаловажную роль в диагностике различных заболеваний.
Недостатки
Существенным минусом ИФА крови является вероятность получения ложноположительных или ложноотрицательных результатов. Но это связано в большинстве случаев не с самим методом исследования, а с человеческим фактором.
Еще один нюанс, способный повлиять на конечные данные, - применяемые в ходе теста медикаментозные препараты. При их неправильном использовании, либо же в случае брака, расшифровка анализов ИФА будет недостоверной. Следовательно, исследование придется проводить повторно.
Важно! Повлиять на данные теста может нарушение обменных процессов в организме пациента. Помимо этого, на результатах может сказаться и наличие сразу нескольких очагов инфекционных (хронических!) заболеваний.
Анализ крови методом ИФА проводится для выявления:
- аскаридоза;
- описторхоза – острого или хронического;
- лямблиоза;
- токсоплазмоза.
Также при проведении исследования в организме пациента могут быть обнаружены острицы или амебы. Диагноз «лейшманиоз» и «трихинеллез» тоже нередко ставятся больным на основании данных анализа крови ИФА.
Подводим итог
Конечно, самостоятельно разобраться в данных теста очень трудно, поскольку во время этого процесса должны учитываться многочисленные факторы. Вредные привычки, наличие сопутствующих заболеваний, применение определенных групп медикаментозных препаратов – все это играет важную роль, и может повлиять на результаты, что и берется в расчет врачами при расшифровке результатов ИФА.
Однако, «осведомлен, значит, вооружен», поэтому каждому человеку важно знать особенности проведения и трактовки данных тех лабораторных исследований, которые ему назначает лечащий врач. И метод ИФА не является исключением!
Методика иммуноферментного анализа применяется в различных отраслях медицины. Но в большинстве случаев данным методом диагностируют широкий круг инфекционных заболеваний, таких как вирус иммунодефицита человека, гепатит, герпес и прочих инфекций половых органов. Также иммуноферментный анализ применяют для выявления онкомаркеров различного происхождения, определения гормонов и при диагностике репродуктивной функции организма. Материалом для иммуноферментного исследования является кровь человека.
Что это такое
Иммуноферментный анализ крови – это лабораторное иммунологическое исследование крови, при котором происходят качественные и количественные измерения антител (антигенов), а также гормонов. Этот метод предоставляет до 90% точности при установлении диагноза заболевания.
Медицинские лаборатории используют несколько вариантов его проведения, что влияет на срок готовности результатов. Но в среднем выдача результатов исследования происходит в период 1-10 дней после сдачи крови.
Какие антитела проверяют
При данном виде анализа крови устанавливаются антитела разных видов – это иммуноглобулины класса M, A, G (JgM, JgA, JgG). Их накопление происходит в различные временные промежутки. Первыми начинают проявляться иммуноглобулины класса М (пятый день после начала болезни). Такие иммуноглобулины задерживаются в организме пять-шесть недель, после чего начинают исчезать из крови организма. Именно в данный период времени выявляются антитела класса М.
Вторыми проявляются иммуноглобулины класса G (через три-четыре недели). Они задерживаются в организме несколько месяцев или лет. Во время проведения иммуноферментного анализа крови и расшифровки его результата можно обнаружить возрастание антител класса G. Это свидетельствует о наличии инфекции или реинфекции.
Антитела класса А проявляются в крови на протяжении двух-четырех недель. Но всего лишь 20% из них присутствуют в сыворотке крови. Остальные же входят в состав секрета слизистых оболочек. Иммуноглобулины класса А начинают исчезать в промежутке времени от двух недель до двух месяцев. Данный процесс является свидетельством уничтожения инфекции в организме. Если после выздоровления человека проводился повторный иммуноферментный анализ крови и расшифровка результата показала наличие антител класса А – это свидетельство хронической инфекции.
Расшифровка анализа
Расшифровка результатов анализа может принимать такие значения:
- JgM (-), JgG (-), JgA (-) – отсутствие иммунитета к инфекции;
- JgM (-), JgG (+), JgA (-) – наличие поствакционного или постинфекционного иммунитета;
- JgM (+), JgG (-/+), JgA (-/+) – наличие острой инфекции;
- JgM (+), JgG (+), JgA (+) – наличие обострения хронической инфекции;
- JgM (-), JgG (+/-), JgA (+/-) – наличие хронической инфекции;
- JgM (-) – выздоровление.
В расшифровке (+) является положительным результатом, а (–) – отрицательным результатом.
Помимо уточнения классов антител в расшифровке встречаются количественные их показатели. Но обширное их объяснение может предоставить только лечащий врач.
Сыворотка крови – это прозрачная жидкость с желтым оттенком. После свертывания крови она отделяется от кровяного сгустка. Не содержит фибрина и форменных элементов.
Иммуноферментный анализ сыворотки крови основан на взаимодействии антигена с антителом, причем один из них содержит в своей структуре фермент. При взаимодействии двух компонентов содержимое пробирки должно менять свой цвет. Результаты сравниваются со стандартной цветовой шкалой, и далее устанавливается антиген, который присутствует в материале. Другими словами принцип иммуноферментного анализа сыворотки крови можно объяснить так:
- подготавливаются наборы антигенов (например, возбудители инфекционных заболеваний, аллергены или гормоны);
- пациент сдает кровь на анализ, из которой в лаборатории выделяется сыворотка;
- материал для исследования добавляется в лунки готовых наборов, после чего возникает реакция антиген-антитело;
- оставшаяся сыворотка крови убирается, а обнаруженные антитела распознаются при помощи индикаторов.
Иммуноферментный анализ сыворотки крови считается достоверным. Но в тех случаях, когда произошло неправильное взятие крови для анализа, или была нарушена техника проведения исследования, или же имеются у человека скрытые системные заболевания, результаты иммуноферментного анализа сыворотки крови могут оказаться ложными.
Иммуноферментный анализ сыворотки крови исследует практически все гормоны щитовидной железы, онкомаркеры и различные виды инфекций.
К гормонам щитовидной железы относятся тиреоглобулин (ТГ), тироксин (Т4), трийодтиронин (Т3), свободный тироксин (Т4), свободный трийодтиронин (Т3).
Нормы
Иммуноферментный анализ крови в норме считается, если присущи такие допустимые нормы гормонов щитовидной железы:
- тиреоглобулин (ТГ) – допустимые границы 70 МЕ/мл;
- тироксин (Т4) – 64-146 нмоль/л (50-113 нг/мл);
- трийодтиронин (Т3) – 1,8-2,8 нмоль/л (0,8-2,0 нг/мл);
- свободный тироксин (Т4) – 11-25 пмоль/л (10-27 пг/мл);
- свободный трийодтиронин (Т3) – 4,49-9,3 пмоль/л (2,5-5,8 пг/мл).
В случае исследования половых гормонов иммуноферментный анализ крови в нормедля женщин считается, если в организме выделяется лютеинизирующий гормон (ЛГ) в таких пределах:
- фолликулярная фаза цикла (с первого дня месячных до двенадцатого-четырнадцатого) – 2-14 мЕд/л;
- овуляционная фаза цикла (с двенадцатого дня по четырнадцатый день) – 24-150 мЕд/л;
- лютеиновая фаза цикла (с пятнадцатого-шестнадцатого дня и до начала следующих месячных) – 2-17 мЕд/л.
В норме для мужчин принимается, если половой гормон вырабатывается в пределах 0,5-10 мЕд/л.
При исследовании хронического гонадотропина (ХГ) референсные значения зависят от пола человека.
- У взрослых мужчин и небеременных женщин нормой считается уровень ХГ ниже 5мЕд/мл.
- У беременных женщин результат зависит от срока беременности и может колебаться в пределах 25-49000 мЕд/мл.
Иммуноферментный анализ крови исследует множество онкологических показателей. К ним можно отнести наличие пролактина, эстрадиола, прогестерона, тестостерона, стероид связывающего глобулина (ССГ) и других маркеров. Но интерпретация результата анализа и норм этих показателей должна проводиться только лечащим врачом.
Кроме того, данный метод диагностирует инфекционные (например, краснуха, корь, туберкулез, герпес, сифилис, гепатит, псевдотуберкулез) и аутоиммунные заболевания разного вида, а также устанавливает иммунный статус человека. Но все показатели и полученные результаты должны расшифровываться квалифицированным специалистом.
4.5 4.50 из 5 (6 Голосов)
В диагностике вирусных болезней человека и животных широко применяют методы, основанные на использовании ферментов в качестве метки антигенов и антител. Это группа методов носит название иммуноферментного анализа.
ИФА применяют в двух вариантах: гистохимическом и твердофазном.
Гистохимический вариант ИФА, или иммунопероксидазную реакцию, используют редко. Он аналогичен методу иммунофлуоресценции, но отличается тем, что для постановки реакции используют антитела, меченные не флуорохромом, а ферментом.
Для метки антител обычно применяют ферменты: пероксидазу хрена (чаще), щелочную фосфатазу, галактозидазу и др.
Таким образом, в комплекс антиген + антитело включаются антитела, меченные ферментом, и для обнаружения этого комплекса вносят субстрат (фермент-чувствительное вещество), которое под действием фермента разлагается, образуя цветной продукт ферментативной реакции, хорошо видимый в световом микроскопе.
В качестве субстрата используют ортофенилендиамин, 5-аминосалициловую кислоту или бензидин. К ним добавляют пероксид водорода (Н 2 O 2).
Материалом для выявления вирусных антигенов при этом варианте могут быть: мазки; отпечатки различных органов; парафиновые срезы; культуры клеток. При этом можно использовать как прямой, так и непрямой метод.
Прямой метод . На фиксированный препарат наносят конъюгат (антитела к предполагаемому вирусу, меченные ферментом), выдерживают при 37 °С в течение 1-2 ч во влажной камере, затем препарат отмывают физиологическим раствором от несвязанного конъюгата, подсушивают на воздухе, наносят несколько капель раствора субстрата, инкубируют 5- 10 мин и промывают физиологическим раствором. Затем споласкивают дистиллированной водой, и результат учитывают с помощью светового микроскопа. В положительных случаях, т. е. при наличии антигена в исследуемом материале, видны или диффузное желто-коричневое окрашивание, или гранулы коричнево-черного цвета. В контрольных препаратах окрашивания не обнаруживают.
Непрямой метод . На фиксированный препарат наносят специфическую к предполагаемому вирусу сыворотку, выдерживают при 37 °С в течение 1-2 ч во влажной камере, промывают физиологическим раствором, подсушивают на воздухе и наносят меченную ферментом антивидовую сыворотку, выдерживают при 37 °С 1-6 ч. Далее следует процедура, как в прямом методе.
Твердофазный иммуноферментный анализ (ТФИФА, РЭМА - реакция энзиммеченых антител, ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay) в последние годы широко используют в биологии, в том числе и в вирусологии. Характерная особенность метода в том, что один из компонентов реакции (антиген или антитело) фиксируют на твердом носителе. В качестве носителей используют полистироловые микропанели, шарики, палочки и др.
Этим методом можно обнаружить и идентифицировать антиген, а также выявить антитела и определить их титр в сыворотках крови.
Существует много вариантов метода. Наиболее часто для обнаружения антигенов используют прямой метод («сандвич»-метод). Для этого специфические к предполагаемому антигену антитела фиксируют в лунках микропанелей, в которые вносят исследуемый антиген и выдерживают при 37 °С 1-2 ч. Затем микропанели промывают буферным раствором и вносят в лунки меченные ферментом к предполагаемому антигену антитела, выдерживают при 37 °С 1-2 ч, промывают микропанели, вносят раствор субстрата и выдерживают 5-30 мин. Реакцию останавливают добавлением раствора серной кислоты и учитывают визуально по разности в окраске опытных и контрольных образцов или при помощи спектрофотометрии. Положительные образцы имеют окраску от желтой до оранжево-коричневой.
Обнаружение и определение титра антител проводят непрямым твердофазным методом.
В крупных диагностических лабораториях применяют полностью автоматизированные установки для проведения твердофазного ИФА, позволяющие анализировать от 1000 до 4000 проб ежедневно.
Достоинства ИФА: высокая чувствительность; специфичность; простота техники постановки; требуется минимальное количество компонентов; не требуется специальных приборов; оценку можно проводить визуально; возможность автоматизации, что позволяет его применять для массовых исследований; исследуемые сыворотки не требуют предварительной обработки. Это - экспресс-метод диагностики, так как в течение нескольких часов можно получить ответ.
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .
ИФА или иммуноферментный анализ — современный способ определения многих патологий, в том числе инфекционного характера. Проводится исследование в лабораторных условиях. Основной задачей методики является выявление антител, их наличие указывает на проникновение в организм патогенных агентов. Современная медицина использует анализ ИФА для диагностики многих заболеваний и определения сторонних соединений.
Анализ ИФА: когда и как проводится
Методом ИФА специалистам удается выявить наличие специфических антител (иммуноглобулинов) в сыворотке крови и определить антигены. Иммуноглобулины вырабатываются вследствие сложных нейронных процессов, осуществляемых защитными функциями организма. Они являются естественной реакцией иммунитета на проникновение инородных агентов. На каждый тип патогенного микроорганизма вырабатываются специфические антитела.
Важно: по наличию определенных комплексов, методика иммуноферментного анализа позволяет выявить тип возбудителя в организме человека.
Диагностика посредством ИФА производится для обнаружения следующих заболеваний:
- герпеса;
- гепатита вирусного типа;
- вируса Эпштейна-Барра (герпеса 4 типа);
- цитомегоаловируса.
Исследование крови позволяет выявить основные болезнетворные бактерии, провоцирующие развитие сифилиса, уреаплазмоза и трихомоноза. Посредством анализа, специалисты определяют антитела к 600 видам аллергенов. Проведение иммуноферментного исследования уместно при подготовке к трансплантации органов.
Важно: в некоторых случаях, ИФА выступает дополнительной методикой определения онкологии в организме человека.
Анализ проводится исключительно в лабораторных условиях. Для исследования осуществляется забор венозной крови из локтевой вены. Результаты анализа будут доступны на следующие сутки. Для получения достоверной информации, специалисты рекомендуют соблюдать правила подготовки к ИФА:
- за сутки до исследования необходимо отказаться от употребления острой и копченой пищи;
- алкоголь находится под запретом;
- кровь сдается в утренние часы на голодный желудок;
- перед исследованием необходимо исключить любые физические и эмоциональные нагрузки;
- целесообразно отказаться от курения.
Какие патологии выявляет иммуноферментный анализ
Методом иммуноферментного анализа специалист определяет различные классы иммуноглобулинов, наличие которых указывает на развитие патологических процессов в организме. Так, основными показателями ИФА являются IgM и IgG. Наличие иммуноглобулина IgM указывает на развитие острого патологического процесса. Показатель IgG в крови характерен для стадии выздоровления.
Посредством анализа ИФА специалисты выявляют ряд опасных заболеваний. К их числу относят:
Важно: анализ ИФА назначается для подтверждения сифилиса при получении положительного результата путем сдачи крови на РВ.
Своевременная диагностика позволяет отследить эффективность проводимой терапии и в случае необходимости, провести ее корректировку.
Расшифровка анализа: положительный и отрицательный ответ
Расшифровка результатов ИФА осуществляется специалистом, на основании полученных данных. Ответ может быть как положительным, так и отрицательным.
Положительный ИФА
Результат считается положительным, если в ходе исследования в крови были обнаружены иммуноглобулины класса IgG и IgM. Наличие представленных компонентов указывает на развитие следующих заболеваний:
- сифилиса;
- гепатита вирусного типа;
- ЦМВИ (цитомегаловируса);
- герпеса;
- ветряной оспы;
- болезней, провокаторами которых выступают стафилококки и стрептококки;
- хламидиоза.
При развитии сифилиса, специфические антитела обнаруживаются в крови спустя 14 суток после заражения. По их количеству специалист определяет тяжесть течения болезни. Активная терапия сифилиса позволяет устранить все бактерии через 6 месяцев. Если лечение отсутствует, на полное восстановление организма уйдет не менее 1,5 лет.
Анализ ИФА выявляет гепатит вирусного типа еще в инкубационном периоде, до появления первых симптомов.
ЦМВИ является распространенной патологией, которая встречается у каждого третьего человека. Для населения она не несет опасности, инфицирование происходит в утробе матери.
В норме, антитела к герпетическому вирусу в организме человека отсутствуют. При их обнаружении принято диагностировать острую фазу заболевания.
При развитии ветряной оспы, в крови человека обнаруживаются специфические иммуноглобулины IgM. Они способны сохраняться в организме на протяжении 2-х лет, после полной ликвидации патологии.
Определить болезни, вызванные стрептококками и стафилококками, позволяет двукратная сдача анализа на ИФА. При повторном исследовании, уровень специфических антител стремительно возрастает.
На развитие хламидиоза указывает высокий уровень иммуноглобулина — 1:8 и выше. Показатель способен варьироваться в зависимости от прогрессирования болезни.
Внимание: для подтверждения развития определенного патологического процесса, специалист назначает дополнительные лабораторные и инструментальные исследования. Комплексное исследование позволяет назначить эффективную схему лечения.
Отрицательный ИФА
При отрицательном результате, в крови человека не обнаруживаются специфические иммуноглобулины класса IgM. Возможно наличие IgG, антитела способны сохранятся в организме после перенесенных заболеваний, бактериального и вирусного типа. В некоторых случаях, их наличие в сыворотке крови сохраняется на протяжении десятков лет.
Внимание: правильно расшифровать результаты анализа способен только опытный специалист.
Самостоятельное изучение ответов в большинстве случаев приводит к попыткам постановки диагноза и назначения некорректного лечения, без участия врача. Такое воздействие считается идеальным для дальнейшего прогрессирования патологического процесса.
Наиболее часто на практике используются три варианта твердофазного иммуноанализа - непрямой иммуноанализ, прямой иммуноанализ и иммуноанализ сэндвич-типа. Различия между этими типами иммуноанализа заключаются в следующем. В непрямом варианте иммуноанализа на первой стадии на поверхность лунок полистирольного планшета сорбируется антиген. После удаления несвязавшихся молекул антигена добавляется образец, содержащий специфичные к данному антигену антитела. Образовавшиеся комплексы антиген-антитело детектируются с помощью анти-видовых антител, конъюгированных с какой-либо меткой (Рис. 1А). В прямом варианте иммунанализа детекция сорбированного антигена осуществляется непосредственно с помощью специфичных антител, конъюгированных с меткой (Рис. 1Б). В иммуноанализе сэндвич-типа на первой стадии на поверхность планшета сорбируется не антиген, а антитела, специфичные к исследуемому антигену (антитела подложки). После удаления не связавшихся молекул антител добавляется образец, содержащий антиген. Для детекции образовавшегося комплекса антитела подложки-антиген добавляются вторые антитела, специфичные к другому, пространственно удаленному, эпитопу антигена, конъюгированные с какой-либо меткой (Рис. 1В). Использование в иммуноанализе сэндвич-типа антител, специфичных к двум различным эпитопам антигена, позволяет добиться высокой чувствительности и специфичности при определении антигена даже в таких гетерогенных образцах, как плазма крови.
Рис. 1. Принцип непрямого (А), прямого (Б) и иммуноанализа сэндвич-типа (В)
Непрямой иммуноферментный анализ (indirect ELISA)
Метод непрямого иммуноанализа характеризуется осуществлением 3-х стадийного процесса, на первой стадии которого антиген адсорбируется на специально подготовленном пластике, на второй с антигеном взаимодействуют специфичные к нему антитела, а на третьей в систему вводят антивидовые антитела, конъюгированные с ферментом, обуславливающим проведение индикаторной ферментативной реакции. В данной методике в качестве фермента используют пероксидазу хрена. Реакция проводится в специальных 96-луночных планшетах.
I. Сорбция антигена
В лунки 96-луночного планшета для проведения иммуноанализа сорбируют антиген 0,1-0,5 мкг в лунку в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS). Инкубация проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка (2-х кратная) несвязавшихся молекул антигена осуществляется фосфатно-солевым буфером содержащим 0.1% Tween-20 (PBSТ).
II. Блокировка
Для блокирования мест неспецифического связывания лунки планшета заполняют PBST и инкубируют в течение 10-15 минут при комнатной температуре.
III. Раститровка специфичных антител
Раститровку можно проводить как по горизонтальным, так и по вертикальным рядам планшета. Необходимо отметить, что раститровка антител проводится в том случае, если необходимо подобрать оптимальную концентрацию антител или определить титр. В том случае, если оптимальная концентрация и/или титр антител определены, то используют рекомендованное для данных конкретных антител разведение.
При раститровке в первую лунку ряда вносят готовое разведение антител - в среднем 1-10 мкг в лунку, далее проводят последовательное разведение антител в лунках. Инкубацию со специфичными антителами проводят в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 3 раза.
IV. Добавление антивидовых антител, конъюгированных с ферментной меткой
В качестве детекторных (вторичных) антител используются антивидовые поликлональные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена. Чаще всего используются козьи или кроличьи антитела, специфичные к целой молекуле или к Fc-фрагментам специфичных антител. Концентрация детекторных антител как правило указывается производителем в виде разведения исходного раствора (например, 1:1000). Инкубация со вторичными антителами проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 5-6 раз.
Пероксидаза хрена катализирует реакцию окисления субстрата перекисью водорода. В качестве субстрата пероксидазы хрена используется о-фенилендиамин (ОФД). В результате прохождения реакции образуется окрашенный продукт окисления ОФД.
Раствор субстрата: К 10 мл субстратного буфера (0,1 М Na-цитратный буфер, рН 4,5) добавить 0,01 мл 30% перекиси водорода и 0,2 мл 50х раствора ОФД (340 мг ОФД в 10 мл этилового спирта; хранить при –20°С).
Инкубация проводится в течение 10 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.
V. Остановка ферментативной реакции
VI. Измерение оптической плотности
Прямой иммуноферментный анализ (direct ELISA)
Методика прямого иммуноанализа имеет лишь небольшие отличия по сравнению с методикой непрямого иммуноанализа. Так, стадии I и II одинаковы в обоих типах анализа. Отличие заключается в том, что в прямом варианте иммуноанализа на стадии III используют специфичные антитела, конъюгированные с ферментной меткой. При необходимости также можно проводить раститровку специфичных антител, конъюгированных с ферментной меткой, аналогично описанному ранее для неконъюгированных антител. Стадия IV опускается, а дальнейшие стадии (V-VII) проводятся аналогично описанному выше для непрямого варианта иммуноанализа.
Иммуноанализ сэндвич-типа (Sandwich-type immunoassay)
Рис. 2. Схематическое изображение иммуноанализа «сэндвич»-типа. АТп - антитело подложки, АТд - детекторное антитело, АГ - антиген, М - метка, ковалентно связанная с детекторным антителом, П - подложка, на которую сорбируется антитело подложки.
В данном варианте иммуноанализа (Рис.2) используется пара антител, специфичных к пространственно удаленным эпитопам исследуемого антигена.
I. Сорбция антител подложки
В лунки 96-луночного планшета для проведения иммуноанализа сорбируют антитела подложки 1-2 мкг в лунку в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS). Инкубация проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка (2-х кратная) несвязавшихся молекул антигена осуществляется фосфатно-солевым буфером содержащим 0,1% Tween-20 (PBSТ).
II. Блокировка
Для блокирования мест неспецифичного связывания лунки планшета заполняют PBST и инкубируют в течение 10-15 минут при комнатной температуре.
III. Инкубация с антигеном
В лунки планшета с преадсорбироваными антителами вносят по 50 мкл исследуемого раствора либо стандартных разведений антигена. Разведения антигена должны быть приготовлены на основе PBST, поскольку Tween-20 снижает неспецифичное связывание белковых молекул друг с другом и с поверхностью планшета. И исследуемый раствор, и стандартные разведения антигена вносят попарно (либо по 3 повторности), используя по две (три) лунки на каждое разведение белка. Инкубацию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Отмывка осуществляется раствором PBST 3 раза.
IV. Инкубация с антителами, конъюгированными с ферментной меткой
В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора специфичных антител, конъюгированных с ферментной меткой. Оптимальная концентрация конъюгированных антител как правило указывается производителем (обычно используют концентрацию 2-4 мкг/мл). Инкубация с антителами, содержащими ферментную метку, проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 5-6 раз.
V. Проведение ферментативной реакции, сопровождающейся появлением окрашенного продукта
В лунки вносят по 100 мкл раствора субстрата и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре и постоянном перемешивании.
VI. Остановка ферментативной реакции
Перед измерением оптической плотности проводят остановку цветной реакции с помощью 0,5 М H 2 SO 4 . В лунки с рабочим раствором ОФД после инкубации вносят по 50 мкл раствора 0,5 М серной кислоты. После этого можно сразу приступать к измерению оптической плотности.
VII. Измерение оптической плотности
Оптическая плотность раствора окрашенного продукта измеряется при λ=490 нм с использованием планшетного спектрофотометра.